1.1. Эволюция глаза

Разнообразие приспособлений, с помощью которых живые существа воспринимают свет, очень велико; они есть не только у высших животных, но и у низших многоклеточных и даже у одноклеточных организмов. Так, на поверхности тела некоторых одноклеточных можно обнаружить прозрачные линзообразные зерна, способные к концентрированию света и иногда покрытые с внутренней стороны пигментом. Эти образования часто считают зачаточной формой глаз в животном мире.

Низшие многоклеточные, например, некоторые медузы, имеют светочувствительные органы, так называемые глазки, расположенные на наружной части их чашеобразного тела. Иногда глазок представляет собой слегка приподнятую группу светочувствительных клеток, отделенных друг от друга пигментированными клетками. У беспозвоночных могут присутствовать также одиночные светочувствительные клетки которые, к примеру, у дождевого червя весьма многочисленны и рассеяны в эпидермисе. Наличие реагирующих на свет клеток по разные стороны тела животного создает физическую предпосылку для определения им местонахождения источника света или предмета, заслоняющего свет. У морских звезд, улиток и некоторых других организмов светочувствительные клетки собраны группами в углублениях кожи – зрительных ямках.

Дальнейшее совершенствование органа зрения было направлено на получение достаточно четкого изображения предметов, что происходило по нескольким анатомически различным путям. В первом случае наружная открытая часть ямки сузилась и сама ямка превратилась как бы в темную камеру с отверстием в ней. В результате на задней стенке такого глаза как и в любой темной камере, получается изображение наблюдаемых предметов, причем чем меньше отверстие камеры, тем четче изображение. Во втором случае наружный кожный покров заполнил зрительную ямку, несколько выступая наружу. Это утолщение в ходе эволюции оставалось прозрачным, играя роль собирающей свет линзы, дающей более или менее четкое изображение внешних предметов. Еще одно направление эволюции глаз у беспозвоночных привело к появлению фасеточных глаз, состоящих из многих глазков-трубочек; такими глазами обладают насекомые и ракообразные.

Если у беспозвоночных можно обнаружить все типы глаз – от простых до наиболее совершенных, - то все известные позвоночные, начиная с рыб, имеют парные глаза, снабженные линзой – хрусталиком. В процессе эволюции хрусталик приобрел способность изменять свою кривизну в зависимости от удаленности рассматриваемых предметов, что дало возможность четкой фокусировки изображения на светочувствительном слое глаза. Кроме того, эволюционное совершенствование зрительного аппарата привело к уменьшению расстояния между зрительными клетками, что также существенно улучшило качество изображения; развилась вращательная способность глаза, позволившая быстро находить и удерживать в поле зрения объект наблюдения; образовался зрачок – подвижная диафрагма, регулирующая количество поступающего в глаз света; появились веки, защищающие глаз от повреждения и высыхания. В итоге сформировался очень сложно устроенный глаз высших позвоночных животных и, в частности, глаз человека.

1.2. Устройство глаза человека

Глазное яблоко (рис. 1) имеет неправильную шаровидную форму (впереди выпуклость сильнее выражена). В нем различают передний и задний полюсы, линия, их соединяющая, называется осью глаза и соответствует его максимальному размеру (в среднем 24 мм); экватор глаза разделяет его на переднюю и заднюю половины. Глазное яблоко делится на ядро и капсулу, или стенку глаза.

Ядро глазного яблока включает хрусталик, водянистую влагу и стекловидное тело, которые прозрачны и в большей или меньшей степени способны преломлять свет.

Рис. 1. Глаз человека. Дана схема горизонтального разреза правого глазного яблока. 1 - передний полюс глаза, 2 - роговица, 3 - передняя камера, 4 - радужная оболочка, 5 - задняя камера, 6 - хрусталик, 7 - ресничный поясок, 8 - ресничное тело, 9 - стекловидное тело, 10 - экватор глаза, 11 - склера, 12 - сосудистая оболочка, 13 - сетчатка, 14 - зрительная ось, 15 - ось глаза, 16 - фовеа, 17 - желтое пятно. 18 - зрительный нерв

Хрусталик имеет вид двояковыпуклой линзы с большей кривизной задней поверхности. Он помещен в выемку, находящуюся спереди стекловидного тела, хотя главную роль в его фиксации играет особая связка - ресничный поясок. Вещество хрусталика, совершенно прозрачное и бесцветное, не содержит сосудов и нервов, снаружи оно облечено в бесструктурную прозрачную капсулу. Хрусталик прозрачен потому, что эпителиальные клетки, из которых он состоит, в процессе дифференцировки утрачивают свои органеллы и в них сохраняются лишь некоторые продольно расположенные микротрубочки и скопления свободных рибосом. Волокна хрусталика построены из характерного для них белка кристаллина.

Водянистая влага представляет собой текучую, прозрачную жидкость, выделяемую кровеносными сосудами и содержащую большую часть растворимых веществ плазмы крови; в ней, как и в кровяной сыворотке, отсутствует фибриноген. Водянистая влага содержит некоторое количество гиалуроновой кислоты, которая в значительной степени деполимеризована, что, по-видимому, и обусловливает низкую вязкость этой жидкости. Водянистая влага заполняет переднюю и заднюю камеры глаза. Передняя камера имеет форму сегмента шара и ограничена спереди роговицей, сзади – передней стороной радужной оболочки, а в области хрусталика – его передней поверхностью. Задняя камера – это щель, идущая вокруг хрусталика, ее передней стенкой служит радужная оболочка, задней - ресничный поясок и хрусталик.

Стекловидное тело, на которое приходится основная масса глазного яблока, имеет форму шара, прилегающего большей частью своей поверхности к сетчатке. Стекловидное тело представляет собой светлое, прозрачное аморфное вещество, с поверхности покрытое прозрачной бесструктурной оболочкой и состоящее из белка витреина и гиалуроновой кислоты.

Капсула (стенка) глазного яблока включает в себя три слоя (по медицинской номенклатуре – оболочки): наружный опорный, средний, или увеальный, и внутренний, или сетчатый. (Термины "внутренний" и "наружный" применяются относительно центра и периферии глаза, т.е. внутренний слой расположен ближе к центру глаза, наружный - соответственно дальше от него; это же относится и к наименованию более тонких слоев и структур, входящих в состав любого слоя капсулы).

Опорный слой глаза охватывает его снаружи и состоит из двух отделов: склеры и роговицы. Склера, или белочная оболочка, имеет большую, чем роговица поверхность. Она окрашена в белый цвет, непрозрачна, кровеносных сосудов имеет мало; то, что обычно называют "белком" глаза, - это видимая снаружи часть склеры. Вместе с роговицей склера практически полностью охватывает глаз за исключением тех точек, где ее пронизывают кровеносные сосуды, и расположенного сзади отверстия для зрительного нерва, в фиброзную оболочку которого она и продолжается. Спереди склера, резко меняя свою структуру и физические свойства, непосредственно переходит в роговицу, которая покрывает центральный участок переднего отдела глаза. Роговица, прозрачная и заметно выпуклая, состоит из плотной соединительной ткани и совершенно лишена кровеносных сосудов; снаружи она покрыта многослойным плоским эпителием, изнутри – слоем плоских клеток.

Средний слой глазной стенки (увеальный слой, увеа) богат пигментом и кровеносными сосудами, благодаря чему его называют также сосудистой оболочкой глаза. Средний слой лежит на внутренней поверхности опорного слоя и в двух задних третях глаза он представлен лишь тонкой, имеющей бурый цвет собственно сосудистой оболочкой, которая сзади пронизана отверстием для зрительного нерва. Ближе к передней части глаза средний слой утолщается, образуя так называемое цилиарное (ресничное) тело с цилиарными отростками, расположенное в виде кольца в области перехода склеры в роговицу. Продолжаясь вперед цилиарное тело переходит в радужную оболочку, или радужку. Радужная оболочка разделяет переднюю и заднюю камеры глаза и имеет форму фронтально поставленного диска с отверстием в центре (зрачок), диаметр которого может изменяться в пределах 3-6 мм с помощью мышц, заложенных в соединительнотканной основе радужки. Спереди радужная оболочка покрыта слоем плоских клеток, задний ее слой сплошь состоит из пигментных клеток. Окраска радужки может меняться – в зависимости от количества присутствующего в ней пигмента — от светлосерой и светлоголубой до темнокоричневой и почти черной; у альбиносов пигмент нацело отсутствует, так что радужка у них имеет красный цвет благодаря обильным кровеносным сосудам.

Сетчатая оболочка, или сетчатка (иначе – ретина), - самая внутренняя оболочка глаза - генетически и функционально составляет единое целое со зрительным нервом, который входит в глазное яблоко несколько медиальнее заднего полюса глаза. Немного латеральнее находится самое светочувствительное место сетчатки – так называемое желтое пятно, имеющее центральную ямку (фовеа). Протяженность сетчатки та же, что и у средней, сосудистой оболочки глаза, к которой она прилегает своей наружной поверхностью; внутренняя поверхность сетчатки граничит со стекловидным телом. В сетчатке различают две неравные части: а) меньшую, переднюю часть, которая прилегает к цилиарному телу и радужке и не содержит чувствительных к свету элементов; б) большую, заднюю часть, прилегающую к сосудистой оболочке и простирающуюся до цилиарного тела. Задняя часть сетчатки содержит фоторецепторные клетки, которые обусловливают ее важнейшее свойство - светочувствительность. Благодаря этому свойству сетчатку часто сравнивают со светочувствительным слоем фотопленки, хотя такое сравнение не совсем удачно: функция сетчатки в отличие от фотопленки не сводится лишь к восприятию света. Уже на уровне сетчатки происходит анализ зрительной информации, получаемой фоторецепторами, и выделение наиболее существенных элементов зрительных образов (направление и скорость движения, величина объекта и др.), с тем, чтобы в центральную нервную систему был передан набор более важных признаков наблюдаемого объекта.

Рассмотрим теперь строение зрительной части сетчатки – этого "мозга на периферии" – более обстоятельно, заметив, что речь пойдет только о сетчатке позвоночных.

1.3. Строение сетчатки позвоночных

Зрительная часть сетчатки состоит из двух слоев, различимых микроскопически: прилегающего к внутренней поверхности сосудистой оболочки пигментного слоя и контактирующего ее стекловидным телом нервного слоя сетчатки.

Пигментный слой принято включать в состав сетчатки, хотя он не вовлекается в передачу зрительного сигнала и анатомически более тесно связан с сосудистой оболочкой, чем с нервным слоем сетчатки. В некоторых условиях, например, даже при незначительном вытекании стекловидного тела в результате хирургической операции, может происходить отслоение нервного слоя сетчатки от пигментного эпителия, приводящее к дегенерации ее нервных клеток.

Пигментный слой получает питательные вещества из кровеносных сосудов средней оболочки глаза и обеспечивает потребности собственно фоточувствительных клеток. Он состоит из моноклеточного слоя высокопигментированных гексагональных клеток, расположенных на мембране. С противоположной от мембраны стороны на клетках пигментного эпителия присутствуют цилиндрические структуры – микроворсинки, которые прилегают к наружным сегментам фоторецепторных клеток, но не связаны с ними. Микроворсинки играют важную роль в обновлении наружных сегментов фоторецепторных клеток, как бы слущивая путем эндоцитоза самую крайнюю в данный момент часть наружного сегмента фоторецептора. Наконец, пигментный эпителий поглощает ту значительную часть попавшего в глаз света, которая, проходя через более внутренние слои сетчатки, не поглотилась ими; т.е. здесь уместна аналогия между функциями пигментного эпителия и черного покрытия внутренней поверхности фотокамеры, сводящейся к поглощению "лишнего", рассеянного света.

Нервный спой сетчатки устроен очень сложно и в свою очередь состоит из 9 слоев; т.е. сетчатка в целом, с учетом пигментного эпителия, включает 10 слоев. Следует заметить, что не все они представляют собой истинные слои, которые могут быть физически отделены друг от друга, скорее это микроскопически различимые зоны, отличные друг от друга составляющими их элементами. Но прежде чем перечислить эти слои, рассмотрим основные типы клеток, их образующих.

Собственно сенсорную функцию в сетчатке выполняют фоторецепторные клетки, палочки и колбочки, представляющие собой высокоспециализированные нейроны. Палочек в сетчатке человека примерно 120 миллионов, причем расположены они преимущественно по периферии зрительной части сетчатки. Колбочки – их около 7 миллионов на сетчатку - концентрируются в центральной ее зоне; особенно высока плотность колбочек в центральной ямке (фовеа). Палочки отвечают за сумеречное зрение при низкой освещенности, которое имеет разрешающую способность (остроту) и преобладают у животных, ведущих ночной образ жизни. Колбочки эффективно работают при достаточно ярком освещении и обеспечивают цветное зрение, имеющее высокую остроту; соответственно их больше у животных, активных преимущественно днем.

Оба типа фоторецепторов – это длинные, узкие клетки, а свое название они получили из-за формы их наружных сегментов, которые у палочек – тонкие, цилиндрические, у колбочек – значительно более утолщенные. Наружный сегмент – часть фоторецепторной клетки, которая своим окончанием вдается в пигментный слой сетчатки и, следовательно, обращена кнаружи глаза. В наружном сегменте присутствуют зрительный пигмент и катаболические ферменты, необходимые ему для выполнения функции световой антенны. Через тонкую ножку (цилию) наружный сегмент соединен с внутренним, который обращен внутрь глаза и содержит ядро, митохондрии, рибосомы и другие клеточные органеллы. Для внутреннего сегмента характерна очень высокая метаболическая активность. Оконечность внутреннего сегмента, противоположная наружному, переходит в аксон, снабженный синаптическим окончанием, в котором обычно присутствуют эндоплазматический ретикулум, митохондрии и многочисленные синаптические пузырьки. В темноте из них постоянно выделяется нейромедиатор, который воздействует на постсинаптические окончания дендритов, принадлежащих уже нейронам второго порядка: биполярным и горизонтальным клеткам.

Биполярные клетки, как и фоторецепторы, ориентированы перпендикулярно поверхности сетчатки. Их дендриты направлены кнаружи и образуют синапсы с аксонами фоторецепторов. С помощью своих аксонов, обращенных внутрь, биполяры взаимодействуют с дендритами ганглиозных клеток, - нейронов третьего порядка.

От ганглиозных клеток, названных так из-за внешнего сходства с клеточными элементами ганглиев, к внутренней поверхности сетчатки тянутся их немиелинизированные аксоны. Выйдя на поверхность, они изгибаются под прямым углом в направлении зрительного нерва, который собственно и образован немиелинизированными аксонами ганглиозных клеток. Цепь фоторецепторы – биполяры – ганглиозные клетки выполняет функцию прямого пути передачи зрительных сигналов, иначе говоря, биполяры обеспечивают вертикальные связи между фоторецепторами и ганглиозными клетками. За взаимодействия по горизонтали, т.е. в латеральном по отношению к поверхности сетчатки направлении, отвечают горизонтальные клетки – на уровне синапсов фоторецепторов с биполярами – и амакриновые клетки – на уровне синапсов биполяров с ганглиозными клетками.

Следует также упомянуть глиальные, или мюллеровы клетки, служащие опорными элементами в нервном слое сетчатки. Они простираются от внутренней границы сетчатки до фоторецепторного слоя, где их наружные окончания соединены с палочками и колбочками с помощью синаптических комплексов.

Таким образом, нервный слой сетчатки образован нейронами следующих типов: по вертикали – это фоторецепторы (палочки и колбочки), биполяры и ганглиозные клетки, по горизонтали - горизонтальные и амакриновые клетки. Из них фоторецепторы снабжены только аксонами, амакриновые клетки аксонов не имеют, но у них есть дендриты. Биполярные, ганглиозные и горизонтальные клетки обладают нервными отростками обоих типов причем дендриты горизонтальных клеток образуют синапсы с колбочками, а их аксоны – с палочками.

Однако эта относительно простая картина осложняется еще и тем, что в пределах одного типа клеточные элементы тоже могут быть гетерогенными.

Так, существуют три варианта колбочек, которые не различаются морфологически, но содержат один из трех зрительных пигментов цветного зрения с разными максимумами поглощения, и, следовательно, могут быть различены микроспектрофотометрически. Биполярные клетки подразделяются в зависимости от того, с какими фоторецепторами – палочками или колбочками – они образуют синапсы; в свою очередь, популяция колбочковых биполяров тоже гетерогенна. Два типа горизонтальных клеток, неотличимые морфологически, дифференцированы по функции: одни гиперполяризуются в ответ на освещение, другие – гиперполяризуются или деполяризуются в зависимости от длины волны возбуждающего света. Наконец, ганглиозные клетки классифицируются по характеру их дендритного древа, а также в зависимости от того, обслуживают ли они палочки, колбочки или контролируют реакцию зрачка на свет.

Говоря о нейронах сетчатки, нельзя не сказать, что в ней помимо обычных синапсов присутствуют также своеобразные лентовидные синапсы, для которых характерно наличие так называемой синаптической ленты - стержнеобразной структуры, ось которой перпендикулярна синаптической мембране; по обе стороны ленты расположены синаптические пузырьки. Благодаря такому строению лентовидного синапса входящее в его состав пресинаптическое окончание способно стимулировать сразу два взаимодействующих с ним постсинаптических окончания. Подобное устройство имеют, например, синапсы между фоторецепторами, с одной стороны, и горизонтальными и биполярными клетками, с другой, Здесь, в случае палочек фоторецепторные аксоны образуют синапсы с дендритами биполяров и аксонами горизонтальных клеток, в случае колбочек - опять же с дендритами биполяров, но в отличие от палочек, не с аксонами, а с дендритами горизонтальных клеток. На самом деле, ситуация еще запутанней, т.к. на одном синаптическом окончании колбочкового аксона локализовано сразу несколько сложных лентовидных синапсов.

Даже схематичное описание нейронов и межнейронных связей в сетчатке дает представление о степени сложности этой системы. Две ее характерные черты: а) уже упоминавшееся наличие не только вертикальных, но и горизонтальных связей между нейронами; б) превышение числа нейронов первого порядка (фоторецепторов) над числом нейронов второго порядка (биполяров), которых, в свою очередь, больше, чем нейронов третьего порядка (ганглиозных клеток), создают основу для суммации афферентных импульсов, посылаемых фоторецепторами, перед тем как ганглиозные клетки передадут информацию по зрительному нерву в мозг.

Мы рассмотрели основные типы клеток, входящих в нервные слои сетчатки; перечислим теперь сами эти слои, напомнив, что всего их, с учетом пигментного эпителия, десять.

Самый наружный слой сетчатки – это, как уже говорилось, слой пигментых эпителиальных клеток. За ним расположен слой наружных и внутренних сегментов фоторецепторных клеток, но без их ядер. Далее следует так называемая наружная, пограничная мембрана, которая на самом деле не содержит специфических мембранных структур, а состоит из синаптических комплексов между фоторецепторными и мюллеровыми клетками. За наружной пограничной мембраной следуют: наружный ядерный слой, образованный плотно упакованными ядрами палочек и колбочек, затем наружный синаптическик или сетчатый, слой, в котором аксоны фоторецепторов образуют синапсы с биполярными и горизонтальными клетками (синапсы колбочек в этом слое расположены на одном уровне, синапсы палочек – на разных уровнях). Следующий, внутренний ядерный слой состоит из ядросодержащих частей биполярных, горизонтальных и мюллеровых клеток; ядра амакриновых клеток расположены ближе к следующему, более внутреннему слою. Внутренний синаптический, или сетчатый, слой, включает в себя синапсы аксонов биполяров с дендрнтами ганглиозных клеток. От крупных ганглиозных клеток, составляющих одноименный слой – слой ганглиоэных клеток – отходят аксоны, которые образуют следующий слой нервных волокон. На границе между стекловидным телом и сетчаткой расположен последний ее слой – внутренняя пограничная мембрана, – состоящая из окончаний отростков мюллеровых клеток и их базальной мембраны.

Следует заметить, что сетчатку позвоночных животных называют инвертированной (наружные сегменты фоторецепторов ориентированы от поступающего в глаз света), в отличие от неинвертированной сетчатки беспозвоночных (наружные сегменты фоторецепторов направлены внутрь глаза, т.е. к свету). Такое строение сетчатки позвоночных обусловлено скорее не функциональными причинами, а ее эволюционной предысторией. Инвертированность сетчатки приводит к некоторым нежелательным явлениям, в частности, к рассеиванию света до его попадания на фоторецепторы и наличию слепого пятна в месте выхода из глаза зрительного нерва. Тем не менее, сетчатка и глаз в целом в большинстве случаев, как мы знаем из собственного опыта, успешно справляется со своими задачами, достаточно адекватно передавая около 1/3 всей информации, поступающей из внешнего мира через синаптические органы в центральную нервную систему.

В этом разделе, посвященном рассмотрению строения глаза и сетчатки, события разыгрывались на анатомическом и гистологическом уровнях, – отсюда схематичность изложения. Следующий раздел посвящен строению, составу и некоторым функциональным характеристикам фоторецепторной клетки, главным образом – ее наружному сегменту, в котором собственно и происходят те биохимические процессы, что лежат в основе фототрансдукции: преобразования энергии светового кванта в электрофизиологический ответ.

2. ФОТОРЕЦЕПТОРНАЯ КЛЕТКА

2.1. Морфология

Как уже было сказано, фоторецепторы, как палочки, так и колбочки, - это узкие, длинные клетки (рис. 2), представляющие собой высокоспециализированные сенсорные нейроны.

Они состоят из нескольких, достаточно хорошо различимых отделов. Наиболее дистальная часть фоторецептора – наружный сегмент – связана узкой (диаметр около 0,25 мкм) соединительной перемычкой, или цилией, с внутренним сегментом, который через ножку, более длинную у палочек, чем у колбочек, продолжается в ядерно-цитоплазматическое тело клетки. От клеточного тела отходит аксон, оканчивающийся синаптической терминалью: у палочек - это "сферула", у колбочек – "ножка",

2.1.1. Внутренний сегмент

Во внутреннем сегменте фоторецепторных клеток различают две части: миоид и элипсоид. В расположенной ближе к клеточному ядру миоидной части сосредоточены шероховатый эндоплазматический ретикулум, свободные рибосомы, комплекс Гольджи. Элипсоид, который находится по соседству с наружным сегментом, образован скоплением митохондрий.

Синтезируемые во внутреннем сегменте компоненты поступают в наружный сегмент через цилию. Здесь, в основании наружного сегмента имеется аксонема, у которой девять пар микротрубочек расположены по ее периферии, а центральная пара отсутствует. Свое начало ресничка берет от базального тельца, находящегося в апикальной части внутреннего сегмента и продолжается до середины наружного сегмента в палочках и еще дальше – в колбочках.

Рис. 2. Схема палочки (а) и колбочки (б) сетчатки позвоночных. 1 – наружный сегмент, 2 – внутренний сегмент (а - эллипсоид, б – миоид), 3 – клеточное ядро, 4 – аксон и синаптическое окончание.

2.1.2. Наружный сегмент

Наружный сегмент палочек (НСП) имеет цилиндрическую форму и по диаметру примерно равен внутреннему. У лягушки НСП имеет диаметр 5-7 мкм, длину 35-50 мкм, объем 1*10^-12 л; у человека соответствующие параметры НСП равны 2 мкм, 40-60 мкм, 1*10^-13 л, у быка – 2 мкм, 7-10 мкм, 2,7*10^-14 л. У колбочек внутренний сегмент, более короткий и толстый чем у палочек, превышает по диаметру наружный, который имеет коническую форму. Отсюда, по форме наружных сегментов и название: палочки и колбочки.

Существование тонкой перемычки между наружным и внутренним сегментами фоторецепторов оказалось счастливым обстоятельством, которое сильно облегчило исследование НСП. Дело в том, что НСП могут быть легко получены в высоко-очищенном состоянии с хорошим выходом после гомогенизации препаратов сетчатки в мягких условиях или путем их встряхивания в растворе Рингера, так как при этом происходит разрушение цилии, НСП отламываются, а клеточная мембрана в месте отрыва замыкается; в результате образуется замкнутая структура. Если процедура проведена аккуратно и в мягких условиях, то в процессе выделения НСП сохраняют характерную структуру и не теряют содержащиеся в них компоненты. Особенно успешные результаты достигаются, когда отделение НСП от примесных структур выполняют с помощью центрифугирования в градиенте плотности в изоосмотической среде с высокой вязкостью. Удается также получить такие препараты НСП, которые не только сохраняют свою целостность, но и содержат фрагменты внутренних сегментов, что позволяет поддерживать нормальные электрофизиологические параметры НСП в течение нескольких часов.

Структура наружных сегментов фоторецепторных клеток в течение многих лет исследовалась методами оптической, позднее – электронной микроскопии. Существование ламеллярных структур в НСП, перпендикулярных продольной оси палочек, было отмечено еще в 1935 году. Позднее, благодаря тому, что НСП имеют выраженную регулярную, почти кристаллическую структуру, для их изучения были применены методы рентгеновского и нейтронного дифракционного анализа. Несмотря на малые размеры и лабильность структуры наружных сегментов фоторецепторов, полученные разными авторами результаты привели к единому мнению относительно их строения. Сегодня считается общепринятым, что НСП в онтогенезе развивается из цилии и представляет собой стопку из сотен или даже тысяч так называемых фоторецепторных дисков, помещенных в "мешок", образованный плазматической мембраной, или плазмалеммой.

2.1.3. Строение фоторецепторных дисков

Фоторецепторные диски образуются у основания НСП как впячивание плазматической мембраны, причем внутреннее пространство вновь образованных дисков еще сообщается с внеклеточным пространством. Позднее диски как бы отпочковываются от плазматической мембраны, превращаясь в замкнутые структуры, и становятся независимыми как от нее, так и друг от друга. Тем самым наружная поверхность плазматической мембраны оказывается внутренней поверхностью дисков, а их просвет как бы ведет свое происхождение от внеклеточного пространства. Этот вывод подтверждается тем, что участки гликопротеинов, присутствующие на внешней поверхности плазматической мембраны НСП (их обнаруживают по способности связывать конканавалин А), у дисков локализованы на поверхности мембраны, обращенной в просвет, но отсутствуют на цитоплазматической стороне дисковых мембран.

Наружные сегменты колбочек по своему строению принципиально отличаются от НСП тем, что колбочковые диски представляют собой складки плазматической мембраны, и их внутреннее пространство сообщается с внеклеточной средой. Следует сказать, что при существующем многообразии форм фоторецепторных клеток этот признак (палочковые диски – плоские мешки, колбочковые диски – складки плазматической мембраны) у многочисленных видов позвоночных животных – наиболее устойчивая отличительная черта колбочек и палочек; хотя и здесь возможны исключения.

Если в поперечном разрезе диск выглядит как две параллельные мембраны, разделенные узким пространством и соединенные по краям, то в плане - это действительно диск, хотя и не идеальной формы; его край имеет разрезы, иначе – инциссуры, направленные от периферии к центру и придающие диску дольчатый вид. Глубина и число разрезов варьирует в зависимости от вида: у приматов и амфибий их более двух десятков, тогда как у грызунов – только один глубокий разрез. Поскольку диски расположены друг над другом стопкой, то разрезы образуют как бы желобки, идущие вдоль НСП, и в этих желобках помещаются микротрубочки, берущие начало в аксонеме у основания наружного сегмента. Такое строение фоторецепторных дисков характерно для палочек, у колбочковых дисков края ровные.

Подавляющая часть массы НСП представлена фоторецепторными дисками, тогда как на плазмалемму приходится всего лишь 1-5% общей массы мембран НСП. Число фоторецепторных дисков на один наружный сегмент, как уже было сказано, может варьировать: в НСП быка их содержится около 500, у человека – 1000, у лягушки - примерно 2000. Толщина мембраны дисков равна 60-70 Å, расстояние между мембранными поверхностями в просвете диска – 10-30 Å, зазор между дисками – 150 Å, т.е. расстояние между центрами дисков составляет примерно – 300 Å.

Даже после удаления плазматической мембраны диски могут еще оставаться собранными в стопки. По-видимому, за стабилизацию архитектуры НСП в значительной степени отвечает краевая структура фоторецепторных дисков, которая отличается по своему составу и некоторым свойствам от их ламеллярной части. От краевой структуры, расположенной вокруг диска по его периферии, тянутся многочисленные филаменты, которые связывают диски друг с другом; в ламеллярной области этих нитей много меньше, чем по краям.

У млекопитающих и амфибий выявлены также филаменты, соединяющие фоторецепторные диски с плазматической мембраной НСП. У жабы они очень короткие (менее 10 нм), у быка и крысы - более длинные (до 30 нм) и разветвленные. Эти филаменты после разрушения дисков могут удерживать связанными между собой фрагменты разрушенных дисков и плазматической мембраны. Они нужны, по всей видимости, для удержания плазматической мембраны НСП вблизи фоторецепторных дисков. Маловероятно, что филаменты одновременно служат еще и каналами, соединяющими внутридисковое и внеклеточное пространство; преобладает мнение, что диски осмотически и электрически отделены от плазматической мембраны НСП. Хотя высказывалось предположение, что между внутридисковым и, внеклеточным пространством существуют прямые связи.

2.1.4. Обновление фоторецепторных дисков

Палочки и колбочки, будучи нейронами, подчиняются широко известному правилу, гласящему, что нервные клетки не восстанавливаются. Однако это правило не распространяется на палочковые диски, которые в течение всей жизни фоторецепторных клеток претерпевают непрерывное обновление. Как это происходит?

Фоторецепторные диски по мере их образования у основания НСП и отпочковывания от плазматической мембраны постепенно перемещаются в направлении верхушки сегмента, одновременно на их место приходят поступающие со стороны цилии более новые диски. "Старые" диски отшелушиваются с конца НСП, фагоцитируются клетками пигментного эпителия, после чего деградируют под действием его лизосомальной системы.

Процесс обновления фоторецепторных дисков происходит непрерывно и с высокой скоростью: у лягушек ежедневно обновляется до 80 дисков на палочку; это соответствует биосинтезу во внутреннем сегменте 8-10⁷ молекул родопсина в день, что сравнимо со скоростью образования иммуноглобулинов в клетках плазмы крови.

Для изучения синтеза и последующего распределения белков и других соединений в фоторецепторной клетке был использован метод радиоавтографии в комбинации с электронной микроскопией. После введения экспериментальным животным меченых аминокислот радиоактивность в фоторецепторах первоначально локализовалась во внутренних сегментах на полисомах. Затем одни вновь синтезированные белки мигрировали к синаптическому окончанию, другие концентрировались в аппарате Гольджи и отсюда поступали в НСП, где включались во вновь образуемые диски. При импульсном введении радиоактивных предшественников происходило мечение достаточно узкой полосы молодых дисков, за старением которых следили по продвижению полосы радиоактивных белков в направлении кончика НСП. Это было возможно потому, что большая часть присутствующего в НСП белка представлена родопсином – интегральным компонентом фоторецепторных мембран, – который после включения во вновь образованные диски оставался в них на протяжении всего пути от основания до верхушки НСП. Так было установлено, что диск с момента его образования до отшелушивания живет в НСП крысы и мыши 9-10 дней, лягушки – около 2 месяцев.

Если животным вводят не аминокислоты, а радиоактивные предшественники фосфолипидов (глицерин, холин, жирные кислоты), то здесь концентрирования метки не происходит, т.к. фосфолипиды быстро обмениваются и удаляются из НСП. Фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин и фосфатидилсерин метятся относительно медленно, обмен фосфатидилинозита, судя по скорости его мечения и выведения, происходит быстро.

Интересно, что скорость обновления фоторецепторных дисков не постоянна в течение суток; например, фагоцитоз старых дисков у крыс резко ускоряется в течение 0,5-2 часов после рассвета, а спустя еще 1-2 часа вновь возвращается к фоновому уровню, причем этот ритм сохраняется даже при постоянном содержании животных в темноте. При 24-часовом световом дне отшелушивание дисков подавляется, хотя достаточно всего лишь двух часов темноты, чтобы нормальный циркадный ритм их обновления вновь восстановился.

Что касается колбочек, то их диски независимо от возраста остаются частью плазматической мембраны, так что здесь перемещения узкой полосы радиоактивного белка после инъекции животным меченых аминокислот не выявляется.

2.2. Состав

Из морфологического описания фоторецепторной клетки видно, что она представляет собой весьма своеобразную структуру. Во многом необычен и ее состав, что будет видно из последующего изложения, где речь пойдет о компонентах, присутствующих в фоторецепторной мембране и цитоплазме НСП (составы внутреннего сегмента палочек и в целом колбочек останутся за пределами рассмотрения).

Уже было сказано, что основная масса НСП (и наружного сегмента колбочек тоже) представлена фоторецепторными мембранами, среди которых, в свою очередь, преобладают мембраны дисков, тогда как количественный вклад плазмалеммы невелик. Фоторецепторные мембраны построены почти исключительно из белков и липидов (около 60 и 40% обшей массы мембран соответственно; в цитоплазме НСП, заполняющей узкие просветы между мембранами (внутри – и междисковое пространство, зазоры между краем дисков и плазмалеммой) главные компоненты – это белки. Углеводы составляют лишь около 4% сухого веса НСП; из них 25% следует отнести на счет углеводных цепей, присоединенных к N-концевой части молекулы родопсина; кроме того, значительное количество мукополисахаридов выявляется в пространстве между кромкой фоторецепторных дисков и плазматической мембраной. Присутствующий в кромке дисков белок с молекулярной массой свыше 200 кД также содержит углеводы.

2.2.1. Липиды

Около 70% всех липидов фоторецепторных мембран представлено примерно равным количеством фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина; заметно меньше в мембране фосфатидилсерина (11-14% в зависимости от вида животного), среди минорных соединений – фосфатидилинозит и сфингомиелин. На перечисленные липидные компоненты приходится более 95% общего количества мембранных липидов. Низкое содержание холестерина и высокая степень ненасыщенности фосфолипидов в фоторецепторной мембране обусловливают ее низкую вязкость.

Липиды распределены в фоторецепторной мембране скорее всего асимметрично: фосфатидилэтаноламин преобладает на цитоплазматической поверхности дисков, а на поверхности мембраны, обращенной в просвет дисков, больше фосфатидилсерина и фосфатидилхолина.

Из-за низкой вязкости фоторецепторная мембрана представляет собой весьма лабильную структуру, и, тем не менее, ее состав даже более консервативен, чем у других биологических мембран из некоторых жизненно важных органов. Так, например, у крыс на диете с низким содержанием незаменимых жирных кислот – предшественников мембранных липидов –жирнокислотный состав мембран сердца и почек через определенный период времени начинает изменяться, что приводит к различным функциональным нарушениям. В то же время жирнокислотный состав элементов сетчатки не затрагивается, и зрительная функция сохраняется.

2.2.2. Белки

Даже после интенсивной экстракции НСП солевыми растворами с низкой ионной силой (концентрация соли около 10 мМ) основная масса белка (примерно 70%) остается в связанном с мембранами состоянии – это интегральные мембранные белки. Доля полипептидов, которые в таких условиях экстрагируются и переходят в раствор, значительно меньше по суммарной массе, зато они много разнообразнее, чем интегральные мембранные белки.

Экстрагируемые клеточные белки принято, в значительной мере условно, разделять на периферические мембранные и растворимые цитоплазматические. К периферическим мембранным относят белки, которые остаются связанными с мембранами после экстракции изотоническими растворами со средней ионной силой (70-200 мМ солевой раствор), но могут быть экстрагированы с помощью гипотонического шока (5-15 мМ солевой раствор) или, напротив, при очень высокой ионной силе, превышающей физиологические значения. В то время как растворимые цитоплазматические белки экстрагируются при промежуточных значениях ионной силы, например, с помощью физиологического раствора Рингера.

Интегральные мембранные белки НСП представлены преимущественно родопсином, который подобно другим интегральным мембранным белкам не экстрагируется солевыми растворами и может быть получен в свободном от мембран состоянии только после их разрушения, например, с помощью детергента.

Средняя концентрация родопсина в НСП лягушки равна 2,5 мМ, что соответствует примерно 10⁹ молекул на НСП и 10⁶ молекул на диск, а для НСП быка –примерно 10⁶ на НСП и 10³-10⁴ на диск.

Содержание родопсина относительно общего количества белка в НСП составляет около 70%. В мембранах фоторецепторных дисков на родопсин приходится не менее 95%, в плазматической мембране его содержание, видимо, много меньше – примерно 25% общего мембранного белка.

Высказывалось мнение, что и в мембранах фоторецепторных дисков родопсина не 95%, а только 60%. Это мнение основано на том факте, что родопсин из НСП быка (молекулярная масса около 40 кД) при электрофорезе в присутствии ДСН может давать три полосы белка, из которых, как полагают, только одна соответствует родопсину.

Существование в мембранах НСП (как быка, так и лягушки) трех мономеров с молекулярной массой около 40 кД (35, 36,37 кД со стехиометрией 1:2:1) подтверждено и в других работах, но по крайней мере в НСП лягушки все эти полипептиды представляют собой родопсин.

Как бы то ни было, родопсин – главный, и структурно, и функционально, белок фоторецепторных мембран, присутствующий как в дисках, так и в плазматической мембране. Однако из-за того, что на плазмалемму приходится всего лишь незначительная часть общей массы мембран НСП, подавляющее число молекул родопсина сосредоточено в мембранах фоторецепторных дисков.

Так как в нашу задачу не входит рассмотрение колбочек, отвечающих за цветное зрение, скажем лишь, что хромоформ в колбочковых пигментах, как и в палочковом родопсине, служит 11-цис-ретиналь. Однако по структуре белкового компонента колбочковые пигменты в большей или меньшей степени отличаются от опсина, входящего в состав палочкового родопсина.

Количество еще одного белка, присутствующего в фоторецепторной мембране дисков, много меньше, чем количество родопсина (6-28 копий на 1000 молекул пигмента) и не превышает 2-3%; это уже упоминавшийся высокомолекулярный гликопротеин, локализованный в краевой структуре дисков. Молекулярная масса краевого белка из НСП быка и лягушки составляет 220 кД, для НСП лягушки приводится также величина 290 кД.

Помимо родопсина и высокомолекулярного краевого белка во фракции интегральных мембранных белков с помощью окрашивания серебром удается выявить еще 12 минорных полипептидов, три из которых присутствуют в количестве большем, чем одна копия на 1000 молекул родопсина; функции, выполняемые этими белками, неизвестны.

Экстрагируемые белки НСП, как уже было сказано, проигрывают интегральным мембранным белкам по общей массе, но зато они намного богаче по номенклатуре. В НСП лягушки, полученных в условиях, которые с одной стороны, предотвращают "утечку" растворимых белков из разрушенных структур, а с другой – обеспечивают удовлетворительное удаление примесных белков, не имеющих отношение к НСП, с помощью одно- и двумерного электрофореза в присутствии ДСН выявлено около 70 полипептидов, каждый в количестве, превышающем 6х10⁴ копий на НСП, что соответствует примерно одной молекуле на 5х10⁴ молекул родопсина. Так что по сравнению с другими родственными структурами, например, ресничками Paramecium, которые содержат по меньшей мере 250 полипептидов, НСП с их 70 выявляемыми белками значительно более простой объект для исследования.

Обстоятельная "инвентаризация" полипептидного состава НСП лягушки, проведенная в дополнение к аналогичным, на более ранним исследованиям, показала, что из примерно 70 экстрагируемых полипептидов только два (трансдуцин и белок с молекулярной массой 48 кД) присутствуют в НСП в количестве, превышающем одну копию на 100 молекул родопсина. Еще 16 белков (среди них - ФДЭ) представлены 1-10 копиями на 1000 молекул родопсина; относительное количество остальных нескольких десятков компонентов еще меньше.

При обработке НСП изотоническим солевым раствором цитоплазматические белки экстрагируются, а с фоторецепторными мембранами остаются связанными периферические мембранные белки, которые могут быть переведены в раствор только в условиях гипотонического шока.

Периферические мембранные белки представлены в НСП преимущественно трансдуцином и ФДЭ; к ним может быть отнесена также 5'-нуклеотидаза с молекулярной массой 80 кД и сходный со спектрином высокомолекулярный (240 кД) белок, локализованный преимущественно в области между краем фоторецепторных дисков и плазматической мембраной.

Трансдуцин в НСП лягушки по количеству занимает второе место после родопсина; на него приходится около 17% от общего белка НСП (Зх10⁸ копий на НСП). Приводятся различные величины соотношения трансдуцин: родопсин - от 2-3 до 166 копий на 1000 молекул родопсина, но в среднем их молярное отношение можно оценить как 1:10. Трансдуцин способен связывать гуаниловые нуклеотиды и обладает собственной ГТФазной активностью.

Количество ФДЭ в НСП лягушки составляет 1,5% от обшей массы белка, или 1,5х10⁷ копий на НСП. Молярное отношение ФДЭ:родопсин составляет примерно 1:100 (от 1 до 2-3 молекул на 100 молекул родопсина по разным оценкам. Так что соотношение ФДЭ:трансдуцин:родопсин выглядит как 1:10:100.

Растворимые цитоплазматические белки в НСП наиболее многочисленны, однако в количественном отношении, по сравнению с интегральными и периферическими мембранными белками, на которые приходится около 90%, их немного. Существенно и то, что главные мембранные белки идентифицированы и достаточно хорошо изучены, тогда как подавляющее большинство растворимых полипептидов не соотнесено с выявленными в НСП ферментативными активностями.

Среди довольно хорошо изученных цитоплазматических белков НСП прежде всего следует назвать белок с молекулярной массой 48 кД, который идентичен S-антигену, ответственному за аутоиммунное заболевание глаз. Этот белок в НСП лягушки представлен 8,4х10⁷ копиями (примерно 3 копии на 100 молекул родопсина), т.е. его количество всего лишь в несколько раз ниже, чем количество трансдуцина. Из минорных цитоплазматических белков НСП, которые также специально изучались, могут быть названы родопсинкиназа, катализирующая АТФ-зависимое фосфорилирование родопсина, и гуанилатциклаза, связанная, скорее всего, с микротрубочками аксонемы и катализирующая в НСП образование cGMP из GTP (см. разделы 4,5,6).

Помимо перечисленных в этом разделе, в НСП выявлен еще целый ряд ферментативных активностей, которые пока еще не "привязаны" к конкретным полипептидам – мембранным или экстрагируемым. Так, показано, что в НСП протекают процессы ковалентной модификации белков, цитоплазматических и мембранных: фосфорилирование (помимо родопсина), в том числе свегозависимое и метилирование, а также дефосфорилирование фосфопротеинов. Среди протеинкиназ по всей видимости, есть и те, чья активность зависит от cGMF и кальция+фосфолипидов. В НСП выявлены ферменты, катализирующие расщепление фосфатидилинозитдифосфата и еще целый ряд других ферментативных активностей: трансфосфорилазная, Са²⁺ и Mg²⁺ АТФазные, ретинолдегидрогиназная, супероксиддисмутазная. Присутствуют также ретиноидсвязываюшие и некоторые другие белки: тубулин, миозин и кальмодулин. Этот список может быть продолжен, в частности, за счет белков, которые обеспечивают функционирование ионных каналов, имеющихся в фоторецепторных мембранах. Хотя с уверенностью утверждать, что все перечисленные ферментативные активности действительно имеют отношение к НСП не следует, т.к. не исключено, что некоторые из них на самом деле связаны с иными структурами фоторецепторной клетки и присутствуют в препаратах НСП в качестве загрязнений.

Говоря об экстрагируемых белках НСП, нельзя не сказать о способности некоторых из них светозависимо связываться с фоторецепторными мембранами. Это – трансдуцин, родопсинкиназа и 48 кД—белок, которые сравнительно легко экстрагируются из темноадаптированных НСП, но очень прочно связываются с фоторецепторными мембранами на свету. Этим же свойством обладают полипептиды с молекулярной Массой 42 и 80 кД, причем последний, возможно, представляет собой 5'-нуклеотидазу, которая имеет ту же молекулярную массу и также более прочно взаимодействует с освещенными фоторецепторными мембранами.

2.2.3. Низкомолекулярные компоненты

Из низкомолекулярных компонентов упомянем некоторые, наиболее важные для функционирования фоторецептора нуклеотиды и катионы.

Среди них прежде всего следует назвать cGMP, содержание которого в НСП по сравнению с другими клетками аномально велико. Если в обычных клетках находят порядка 10^-7 М cGMP, что много ниже нормальной клеточной концентрации cAMP (порядка 10^-6 М), то уже в сетчатке концентрация cGMP примерно равна клеточной концентрации сАМР и составляет около 5 мкМ, что в 10-100 раз выше, чем в других районах центральной нервной системы; важно, что подавляющая часть cGMP обнаруживается в фоторецепторных клетках, точнее в их наружных сегментах. Оценки общей концентрации cGMP в НСП колеблются в пределах 10-90 мкМ, при этом весьма вероятно, что свободного cGMP в НСП намного (возможно на порядок) меньше, (т.е. большая часть этого соединения находится в связанном с какими-то структурами состоянии). Что касается концентрации других изученных нуклеотидов, то здесь существенных отличий от обычных клеток не наблюдается: в случае сАМР — это величина порядка 10^-6, у АТР и GTP-порядка 10^-3.

В исследованиях, посвященных биохимии и физиологии фоторецепторов, наибольшее внимание по сравнению с другими катионами уделяется кальцию. Общая концентрация этого катиона в НСП, по разным оценкам, лежит, в пределах 0,5-З0 мМ, хотя наиболее вероятная величина равна 2-5 мМ, т.е. примерно та же, что и во внеклеточном пространстве - 1,4-1,8 мМ. Цитоплазматическая концентрация свободного Са²⁺ (1-2 мкМ) много ниже, чем в среднем в НСП, т.к. катион здесь находится преимущественно в связанном с мембранами состоянии, либо заключен внутри дисков. Другой двухвалентный катион – Mg²⁺ – присутствует в НСП, видимо, примерно в той же концентрации, что и Са²⁺. Внутриклеточная концентрация Na⁺ в палочках жабы и саламандры оценивается в 75-140 мМ. Определение содержания Na⁺ в НСП из темноадаптированной сетчатки лягушки дает величину 68 мМ. Для концентрации К⁺ в палочках жабы приводится значение около 90 мМ.

Фоторецепторные мембраны – и дисковая, и плазматическая – имеют толщину около 70 Å и состоят практически целиком из белка и липидов. Понятно, что для того, чтобы фоторецепторная мембрана могла эффективно выполнять функции световой антенны и инициировать фоторецепторный ответ, эти компоненты должны быть в ней определенным образом организованы. Ответ на вопрос, каковы основные черты этой организации, и, тем более, – какова тонкая структура фоторецепторной мембраны, может быть дан с достаточной полнотой только для мембраны дисков, поскольку именно они были главным объектом структурных исследований мембран НСП. О плазмалемме в этом отношении известно мало, в первую очередь из-за ее малого количества – всего лишь несколько процентов по отношению к общей массе мембран НСП.

Обратная картина наблюдается, когда речь идет об электрофизиологических характеристиках, т.к. в этом случае гораздо лучше изучена плазматическая мембрана. И главное здесь то, что основные события, которые происходят в ней и лежат в основе первого этапа электрофизиологического ответа фоторецептора на свет, по-видимому, можно считать установленными.

По указанным причинам структурные характеристики рассматриваются ниже на примере мембран фоторецепторных дисков, а электрофизиологические – приведены для плазматической мембраны НСП.

2.3.1. Структура

Сейчас уже ни у кого не вызывает сомнений, что липидные компоненты образуют в фоторецепторной мембране двойной липидный слой, при этом гидрофильные головы их молекул контактируют со средой (цитоплазма и просвет дисков для дисковых мембран, цитоплазма и внеклеточное пространство для плазмалеммы), а гидрофобные хвосты обращены внутрь мембраны.

Относительно локализации молекул родопсина в фоторецепторной мембране еще сравнительно недавно существовали различные мнения, по сути дела были перебраны все возможные варианты взаимного расположения родопсина и липидов. Так, предполагалось, что молекулы родопсина: а) находятся внутри липидного бислоя ближе к его внутридисковой поверхности; б) симметрично распределены внутри бислоя; в) сосредоточены на цитоплазматической стороне бислоя; г) пронизывают мембраны. При этом некоторые авторы рассматривали как наиболее вероятную такую структуру фоторецепторной мембраны, в которой липидный бислой образует ее цитоплазматическую поверхность, а слой молекул родопсина подстилает липиды и обращен в просвет фоторецепторных дисков.

К настоящему времени построена экспериментально хорошо обоснованная модель, описывающая способ укладки молекул родопсина в фоторецепторной мембране. Это стало возможным благодаря тому, что, во-первых, была установлена полная первичная структура родопсина, подтвержденная с помощью определения нуклеотидной последовательности его гена и аминокислотной последовательности ряда его пептидов; во-вторых, были выполнены исследования структуры НСП и их компонентов методами рентгеновской и нейтронной дифракции и электронной микроскопии.

По сегодняшним представлениям, молекула родопсина – гликопротеина с молекулярной массой около 41 кД, состоящего из 348 аминокислот, - это удлиненный эллипсоид (или цилиндр) диаметром 30-35 нм, большая ось которого ориентирована перпендикулярно поверхности мембрны диска. Толщина липидного бислоя составляет 45 Å, длина эллипсоида - около 70 Å, и он пронизывает липидную мембрану насквозь. Непосредственно в липидном окружении находится несколько более 50% общей массы молекулы родопсина, остальная масса белковой молекулы распределена примерно поровну между частями, одна из которых экспонирована в цитоплазму НСП, другая – во внутридисковое пространство. "Центр тяжести" молекулы родопсина несколько смещен к цитоплазматической стороне мембраны.

Серьезным препятствием на пути к более полной расшифровке пространственной структуры зрительного родопсина было отсутствие успеха в попытках получить его трехмерные кристаллы и с помощью рентгеноструктурного анализа описать полную пространственную структуру этого белка. Тем не менее, сегодня ясны не только общие черты локализации молекулы родопсина, но и во многом установлен характер укладки его полипептидной цепи в фоторецепторной мембране. Решение этой проблемы значительно облегчила структурная аналогия зрительного родопсина с бактериородопсином, для которого была установлена не только полная аминокислотная последовательность, но и построена трехмерная модель молекулы. Кроме того, целый ряд методических подходов, такой как анализ чередования гидрофильных и гидрофобных аминокислот в полипептидной цепи родопсина, использование различных протеиназ, расщепляющих эту цепь в определенных местах, и других методов позволил описать способ укладки полипептидной зрительного родопсина в фоторецепторной мембране с достаточно высокой точностью,

В результате было установлено, что часть молекулы родопсина, погруженная в липидный бислой, содержит почти исключительно гидрофобные аминокислоты, которые образуют семь спиральных тяжей, причем каждый из тяжей пронизывает фоторецепторную мембрану насквозь. Во внутридисковое пространство экспонирован N-концевой фрагмент полипептидной цепи родопсина, к которому присоединены две углеводные цепи с молекулярной массой 2114; сюда же обращены три петли, соединяющие II—III, IV—V и VI—VII тяжи (считая от N-конца). Участки полипептидной цепи родопсина, выходящие из мембраны в цитоплазму НСП, богаты гидрофильными аминокислотами и представлены тремя петлями, соединяющими I-II, III—IV и V—VI тяжи, и С-концом полипептидной цепи, состоящим примерно из 40 аминокислотных остатков. Простерическая группа родопсина - 11-цис-ретиналь - присоединена к аминогруппе 296-го остатка лизина, который находится в -ом α-спиральном "столбе".

Из всего сказанного вытекает, что молекулы родопсина расположены в фоторецепторных мембранах асимметрично (N—концы обращены во внутридисковое пространство, С-концы – в цитоплазму), но это не означает, что полипептидные цепи родопсина жестко зафиксированы. Напротив, из-за того, что рецепторные мембраны имеют низкую вязкость - около ? пуазов, что соответствует консистенции растительного масла, - молекулы родопсина испытывают быстрое вращение, при комнатной температуре время вращательной релаксации составляет примерно 20 мкс) и латеральную, в плане мембраны диффузию (константа диффузии 3-5х10^-9см²сек^-1), сопровождается соударениями каждой молекулы родопсина со своими соседями с частотой 10⁴-10⁵ в секунду.

Следует сказать также и о том, что липиды, непосредственно контактирующие с родопсином в фоторецепторной мембране, несколько отличаются по своей подвижности от таких же, но более отдаленных липидов. Таких "иммобилизованных" липидных молекул насчитывают 24 на молекулу родопсина, причем расчет показывает, что этого достаточно, чтобы образовать липидную "капсулу" вокруг белковой молекулы. Липидных молекул, оставшихся свободными, по-видимому, еще достаточно для того, чтобы построить, как минимум, еще один липидный слой вокруг молекулы пигмента. Уже упоминавшийся консерватизм липидного состава фоторецепторных мембран при дефиците диетарных жирных кислот указывает на то, что липидное окружение родопсина небезразлично для нормального функционирования фоторецептора. Помимо чисто структурных функций, липиды, по всей видимости, предотвращают нежелательную агрегацию молекул родопсина в мембране, оказывают влияние на фотохимические превращения пигмента и некоторые другие его свойства. Тем не менее, можно утверждать, что по крайней мере одна из существенных функций родопсина – способность активировать фосфодиэстеразный каскад (о чем речь пойдет ниже) -сохраняется, хотя и в несколько редуцированном виде, после разрушения фоторецепторных мембран и делипидизации родопсина.

Высказывалась гипотеза, что молекулы родопсина в составе фоторецепторных дисков, мономерные в темноте, при освещении агрегируют с образованием трансмембранных каналов, и этот процесс лежит в основе светозависимой регуляции проницаемости; предполагалось также, что такие агрегаты могут быть достаточно велики и включать в себя до 12 молекул родопсина. Оставляя в стороне вопрос о функциональной значимости агрегации родопсина, укажем на то, что действительно имеются экспериментальные свидетельства в пользу появления агрегатов его молекул в ответ на освещение, полученные на мицеллярных растворах, липосомах со встроенным пигментом или на его двумерных кристаллах. Что же касается мембран НСП, то здесь мнение о существовании значительной светозависимой агрегации родопсина – скорее отрицательное, хотя имеющиеся данные о замедлении вращения молекул белка в фоторецепторных мембранах после их освещения могут быть объяснены как конформационными перестройками полипептидных фрагментов, экспонированных в цитоплазму, так и образованием олигомерных форм пигмента.

Рис. 3. Схема среза фоторецепторного диска. 1 - молекула родопсина, 2 - мембрана диска, 3 - внутридисковое пространство, 4 - инциссура

Итак, фоторецепторная мембрана (рис. 3) – это двойной липидный слой, в ламинарной области которого присутствуют очень подвижные молекулы главного мембранного белка родопсина, по краю диска – преимущественно высокомолекулярный краевой белок, по-видимому, достаточно жестко закрепленный в мембране и выполняющий структурную функцию. Одной молекуле родопсина (в фоторецепторных дисках лягушки) соответствует площадь поверхности фоторецепторной мембраны 3400 Ų, из них около 800 Ų занимает сам родопсин, остальные 2600 Ų приходятся на липиды, среди которых – примерно 65 молекул фосфолипидов, 2-диглицеридов, 5-свободных жирных кислот, 9-холестерина. Расстояние между молекулами родопсина - до 56 Å, его плотность в фоторецепторной мембране – примерно 30 000 молекул на 1 мкм².

2.3.2. Ионные токи и каналы

Хорошо известно, что потенциал покоя на мембране аксона у невозбужденных нервных клеток равен примерно 60 мВ (минус внутри клетки). Возбуждение нейрона сопровождается повышением проницаемости аксональной мембраны для ионов натрия, которые в результате входят внутрь клетки по электрохимическому градиенту т.к. концентрация Na⁺ исходно выше снаружи. Вследствие этого происходит быстрое (за времена порядка миллисекунд) и локальное изменение мембранного потенциала от -60 до +30 мВ – мембрана аксона деполяризуется. Допороговые стимулы вызывают лишь локальную деполяризацию, сопровождающуюся пассивным распространением потенциала от места, где локально изменилась катионная проводимость, вдоль по мембране аксона. При силе возбуждения превышающей пороговую, изменение проницаемости мембраны аксона для ионов Na⁺ приводит к появлению такого локального деполяризационного ответа (генераторного потенциала), который индуцирует активный импульс, распространяющийся вдоль аксона, – потенциал действия.

Фоторецепторная клетка, будучи нейроном, также может находиться в состоянии покоя или возбуждения, однако электрофизиологическая картина, описывающая переход из первого во второе, здесь совершенно иная.

Уже ранние исследования электрофизиологического ответа клеток позвоночных обнаружили, что возбуждение (освещение) приводит не к деполяризации, а к гиперполяризации их плазматической мембраны. Кроме того, в отличие от обычных нейронов, потенциал действия в фоторецепторе не возникает, а вызванное светом более или менее локальное изменение проводимости плазматической мембраны наружного сегмента затем распространяется по всей фоторецепторной клетке, достигая синаптического окончания, где оно модулирует количество выделяемого в синаптическую щель нейромедиатора.

В основе гиперполяризации плазматической мембраны фоторецептора лежит подавление входящего в его наружный сегмент темнового тока. Согласно гипотезе Hagins и соавторы, входящий в наружный сегмент фоторецептора ток – это натриевый ток, величина которого модулируется светом, причем на достаточно ярком свету он может подавлен; эта гипотеза была впоследствии подтверждена в ряде других работ. Так, в одной из них на суспензии НСП показано, что плазматическая мембрана высокопроницаема для входящего натриевого тока (в обратном направлении, т.е. из цитоплазмы наружу, проницаемость мембраны для ионов натрия примерно на три порядка ниже); на свету натриевый ток, входящий в НСП, подавляется.

Рис. 4. Схема ионных токов в НСП

Общая картина основных катионных токов в фоторецепторной клетке сложнее и может быть описана следующим образом (рис. 4). Проницаемость мембраны НСП для ионов натрия выше, чем для ионов калия; во внутреннем сегменте – обратная ситуация: здесь К⁺ лучше проходит через мембрану, чем Na⁺. Ионы натрия, которые активно выкачиваются из внутреннего сегмента с помощью Na⁺/K⁺ АТФазы во внеклеточное пространство, входят оттуда в НСП через светозависимые катионные каналы и затем диффундируют во внутренний сегмент – круг замкнулся. Избыточный калий, который был закачан во внутренний сегмент в обмен на натрий, пассивно уходит через плазматическую мембрану внутреннего сегмента наружу.

Следует заметить, что в НСП через светозависимые каналы вместе с ионами натрия входят также ионы кальция, на которые приходится 10-15% входящего в НСП темнового катионного тока. При этом "лишний" Са²⁺ откачивается из цитоплазмы НСП в обмен на ионы натрия с помощью локализованного в плазматической мембране Na⁺/Ca²⁺ обменника. На натриевый ток, который входит в НСП за счет Na⁺/Ca²⁺-обмена, приходится около 25% всего натриевого тока, входящего в клетку через светозависимые катионные каналы.

На ярком свету наблюдается полное подавление входящего в НСП тока, и сопротивление плазматической мембраны достигает величины, равной 1 мОм/см2 (НСП жабы), что на 2-3 порядка превышает сопротивление обычных клеточных Мембран. Поэтому вполне правдоподобным выглядит мнение, что никаких других катионных каналов, кроме светочувствительных, в плазматической мембране НСП нет. Хотя следует упомянуть потенциалзависимые калиевые каналы, которые, однако, в физиологических условиях себя не проявляют, т.к. присутствуют, скорее всего, в инактивированном состоянии. В НСП выявлена также светонезависимая анионная, преимущественно хлорная, проводимость. Обеспечивающие ее потенциалзависимые каналы имеют выраженную анионную избирательность и не способны пропускать катионы. В темноте на хлорную проводимость приходится менее 10% от общей мембранной проводимости, однако, какова ее роль, остается пока невыясненным.

Прежде чем перейти к рассмотрению свойств светозависимых катионных каналов, остановимся на уже упоминавшемся выше Na⁺/Ca²⁺ обменнике. Его функция заключается в откачке из цитоплазмы НСП лишнего кальция, который входит в фоторецептор через светозависимые катионные каналы, и тем самым - в поддержании цитоплазматической концентрации свободного кальция на необходимо низком микромолярном уровне. Обменник характеризуется стехиометрией 3Na⁺:1Ca²⁺. Катионы Na⁺ не могут быть заменены на Li⁺; K⁺ подавляет Na⁺/Ca²⁺-обмен при высоких концентрациях La3⁺ вызывает полное ингибирование уже при концентрации, равной 10 мкМ. Обменник может также транспортировать Sr²⁺но не Ва²⁺ или другие двухвалентные катионы.

Теперь сосредоточим внимание на свойствах светозависимых катионных каналов, присутствующих в плазматической мембране наружных сегментов фоторецепторной клетки.

Селективность светозависимых каналов, как уже было сказано, не абсолютна. Через них в физиологических условиях помимо входящего натриевого тока течет также более слабый но вполне измеримый кальциевый ток. Кроме того, на изолированных фоторецепторных клетках, суспензии НСП или препаратах плазматической мембраны НСП ряду авторов удалось продемонстрировать, что селективность светозависимых катионных каналов в определенных условиях может быть снижена, и они становятся способными пропускать целый ряд одновалентных [Li⁺, K⁺ Rb⁺, Cs⁺ и Tl⁺] и двухвалентных (Mn²⁺, Ba²⁺ Co²⁺, Mg²⁺ и Sr²⁺) катионов; для анионов проводимость этих каналов очень низкая. Факторами, снижающими селективность светозависимых катионных каналов, а также повышающими их проводимость, были уменьшение концентрации ионов кальция в среде (от обычных миллимолярных значений до микромолярных и ниже), возрастание концентрации cGMP или условия, когда активность ФДЭ в НСП подавлена, что равнозначно повышению в клетке концентрации cGMP.

Заметим здесь же, что снижение концентрации ионов кальция хотя и вызывает повышение катионной проводимости светозависимых каналов, но на их относительную селективность для ряда одновалентных катионов влияния не сказывает. Это же, возможно, справедливо и для эффекта cGMP, т.к. не исключено, что на самом деле действие кальция на каналы опосредовано циклическим нуклеотидом.

Недавние результаты Фесенко и соавт., подтвержденные также другими авторами, продемонстрировали способность cGMP прямо, без посредников действовать на катионную проводимость светозависимых каналов, присутствующих в плазматической мембране НСП. До этой работы прямое действие cGMP (или других циклических нуклеотидов) на проницаемость каналов не было продемонстрировано не только на фоторецепторных, но и на других клетках. Более того, подобная возможность, во всяком случае, в явном виде, ранее вообще не обсуждалась, а усилия были направлены на поиск механизмов, опосредующих влияние cGMP (и других цитоплазматических факторов) на натриевую проводимость плазматической мембраны НСП.

Фесенко и соавт. изучали действие cGMP на катионную проводимость на кусочке плазматической мембраны НСП лягушки Rana temporaria, присосанном к кончику стеклянной микропипетки; наружная поверхность мембраны была обращена внутрь пипетки, а цитоплазматнческая - в перфузионную камеру. С помощью электродов, один из которых находился в перфузионной камере, а другой – в растворе, содержащемся в пипетке, измеряли ток, текущий через мембрану, а также влияние различных соединений на ее катионную проводимость.

Оказалось, что cGMP значительно повышает проводимость помещенного в пипетку кусочка плазматической мембраны НСП. Полумаксимальное действие проявляется при концентрации cGMP, равной 30 мкМ, насыщение достигается в присутствии 300 мкМ cGMP. Величина коэффициента Хилла для связывания cGMP с мембраной – примерно 1,8. Эти цифры хорошо согласуются с данными, полученными на изолированных препаратах НСП жабы, где величины K_m и коэффициента Хилла для связывания cGMP с плазматической мембраной оказались равными 45 мкМ и 2,5 соответственно. Эффект cGMP обратим и может быть воспроизведен несколько раз подряд на одном и том же препарате путем последовательных отмываний мембраны и добавлений циклического нуклеотида в перфузионную камеру.

Способность повышать проводимость мембраны обладает только 3'5'-сСМР, но не 2'3'-cGMP или сАМР. Для проявления эффекта cGMP не требуется присутствия нуклеозидтрифосфатов (АТР или GTP) и, следовательно, он не опосредован какой-либо cGWP зависимой киназой, фосфорилируюшей канальные белки.

Катионы кальция сами по себе, взятые в широком диапазоне концентраций (10^-8-10^-3 М), на проводимость мембраны влияния не оказывают. Однако при снижении концентрации Са²⁺ наблюдается 20-30%-ное уменьшение cGMP— зависимой компоненты проводимости. Показано также, что описанный эффект cGMP может быть выявлен только на плазматической мембране внешнего, но не внутреннего сегмента палочки, и при условии, что циклический нуклеотид добавляется в раствор, омывающий цитоплазматическую поверхность мембраны НСП. Эффект cGMP отсутствует, если он добавлен с внешней стороны плазматической мембраны фоторецептора. Можно, видимо, считать доказанным, что исследуемые в работе cGMP-чувствительные каналы идентичны светозависимым катионным каналам НСП. Результаты аналогичные тем, что получены на палочках и описаны выше, продемонстрированы также на колбочковых мембранах.

Что касается катионов кальция, то имеется обширная литература, например, посвященная иx влиянию на проводимость плазматической мембраны наружных сегментов палочек и колбочек. Данные этих и многих других работ говорят о том, что повышение Са²⁺ в фоторецепторной клетке сопровождается подавлением входящего в ее наружный сегмент натриевого тока. Однако, до сих пор остается невыясненным, каким образом кальций модулирует проводимость плазматической мембраны: прямо связываясь с ней или действуя через какой-либо посредничающий механизм. Если действие кальция на мембрану опосредовано, то участниками такого механизма могут быть ФДЭ и гуанилатциклаза, которые по некоторым данным чувствительны к Са²⁺: активность ФДЭ в НСП стимулируется, а гуанилатциклазы подавляется катионом. Эти эффекты, возможно, лежат в основе влияния кальция на уровень cGMP в НСП, которое выражается в повышении концентрации cGMP в ответ на понижение концентрации Са²⁺.

На вероятное существование механизмов, опосредующих эффект кальция на катионную проводимость плазматической мембраны НСП, указывают данные о его неспособности прямо, 6eз cGMP модулировать натриевый ток через мембрану. Однако следует упомянуть работу, выполненную на изолированной плазматической мембране НСП саламандры, где продемонстрировано прямое влияние Са²⁺ на катионную проводимость мембраны: возрастание концентрации катиона от 100 мкМ до 1 мМ приводило примерно к 5-кратному подавлению натриевого тока через мембранный препарат. В этом случае кальций оказывал свое действие только будучи добавленным с внешней стороны плазматической мембраны НСП, а с цитоплазматической ее поверхности влияния не оказывал. Но и здесь эффект Са²⁺ выявлялся только при измерении cGMP— зависимой натриевой проводимости, а без cGMP изменения натриевого тока в ответ на изменения концентрации катиона были незначительны или вовсе отсутствовали.

Несмотря на полученные в последние годы существенные результаты по влиянию cGMP на натриевую проводимость плазматической мембраны фоторецепторной клетки, относительно механизмов регуляции светозависимых катионных каналов известно очень мало. И основная причина, по-видимому, заключается в серьезных методических трудностях при работе с плазматической мембраной НСП и в отсутствии на сегодняшний день заметного прогресса в выделении и реконструкциии светозависимых катионных каналов. Хотя шаги в этом направлении делаются: совсем недавно появилась работа, где сообщается о выделении из плазматической мембраны белков cGMP-регулируемых каналов и их последующем встраивании в липосомы с реконструкцией ряда исходных характеристик этих каналов.

Функциональные же, электрофизиологические свойства светозависимых катионных каналов, присутствующих в плазматической мембране фоторецепторной клетки, изучены несравненно более полно.

В темноте через плазматическую мембрану НСП течет катионный ток, величина которого у разных животных находится в пределах 12-70 пА. Если принять, что этот ток обусловлен преимущественно ионами натрия, то в НСП с общей поверхностью плазматической мембраны 1200 мкм² (палочка жабы) входит порядка 10⁸Na⁺/сек, что соответствует 1,3-10⁵Na⁺/мкм²*сек. На свету происходит закрывание натриевых каналов, причем суммарный ответ складывается из событий, вызванных единичными фотонами.

Изменение тока на одну фотоизомеризацию родопсина составляет около 1 пА, при этом блокируется вход порядка 10⁶Na⁺/сек; проводимость мембраны изменяется на 25-30 пС. Для ответа на единичный фотон по потенциалу приводятся сильно варьирующие значения: от 0,2 до 6 мВ.

В свою очередь ответ фоторецептора на один фотон состоит из еще более элементарных событий, каждое из которых – закрывание единичного катионного канала; при поглощении одного фотона закрывается 100-300 таких каналов. Время пребывания канала в открытом состоянии характеризуется константой 0,5-0,8 мсек; величина 200 мсек, по всей видимости, завышена, т.к. следует учитывать, что ответ фоторецептора на яркую вспышку развивается за времена порядка сотен миллисекунд. Амплитуда тока для единичного канала равна 3-4 фА что соответствует прохождению через него порядка 10⁴Na⁺/сек; следовательно, за время пребывания канала в открытом состоянии через него проходит порядка 10 ионов натрия. Изменения проводимости для одного канала в плазматической мембране НСП черепахи, лягушки, ящерицы и саламандры равны соответственно 600, 100-250, 50 и 5 фС.

Общее число открытых каналов в НСП лягушки оценивается в 8300 в темноте, что соответствует 7 каналам на мкм² поверхности плазматической мембраны. Хотя максимальное каналов, которые могут быть открыты в присутствии высокой концентрации cGMP или при низкой концентрации ионов кальция, выше примерно в 10 раз, следовательно, их в НСП лягушки - порядка 10⁵ или около 100 на мкм² поверхности мембраны; для НСП саламандры приводилась величина порядка 10⁴, но при этом указывалось, что она наверняка занижена. Так, что даже в темноте количество каналов, которые находятся в открытом состоянии, меньше 10% или даже еще ниже – около 1%.

Завершая рассмотрение структуры мембраны фоторецепторных дисков и электрофизиологических свойств плазматической мембраны НСП, еще раз заметим, что если для плазмалеммы сейчас имеется достаточно ясная электрофизиологическая картина, то в случае дисковой мембраны такой определенности нет, в частности, до сих пор непонятно, присутствуют ли в ней какие-либо ионные каналы. И если очевидна роль фоторецепторных дисков как компартмента, в котором сосредоточена практически вся масса родопсина, то в какой мере важны электрические свойства их мембраны для развития фоторецепторного ответа, сказать трудно. (Подробнее со свойствами дисковой мембраны можно ознакомиться в монографии Волотовского и Конева "Структурная динамика фоторецепторного аппарата".)

3. ФОТОРЕЦЕПТОРНЫЙ ОТВЕТ

Во многих электрофизиологических работах фоторецепторная клетка рассматривается как "черный ящик", и для него описывается зависимость выходных характеристик, например, потенциала на плазматической мембране, от входных параметров: интенсивности световой вспышки, её продолжительности и др. Эти работы дают представление о феноменологии фоторецепторного ответа. В то же время в многочисленных работах по биохимии фоторецепции исследуется, так сказать, содержимое этого "черного ящика", т.е. процессы, которые служат биохимической основой фототрансдукции – преобразования энергии светового кванта в электрофизиологический ответ фоторецепторной клетки.

>3.1. Феноменология

К наиболее характерным явлениям, которые описаны при изучении ответа фоторецепторов на световой стимул, могут быть отнесены: ранний рецепторный потенциал; поздний рецепторный потенциал; световая адаптация; темновая адаптация.

3.1.1. Ранний рецепторный потенциал

После быстрой и достаточно интенсивной вспышки света, вызывающей фотовозбуждение нескольких процентов родопсина, на сетчатке с практически нулевой латентностью может быть зарегистрировано появление раннего рецепторного потенциала (РРП), который существует всего лишь несколько миллисекунд после прекращения светового стимула. Амплитуда РРП пропорциональная числу фотовозбужденных молекул родопсина, а насыщение ответа достигается лишь при очень интенсивных вспышках света, вызывающих фотовозбуждение всех имеющихся в наличии молекул родопсина. РРП, регистрируемый на клочках сетчатки, генерируется в плазматической мембране НСП, и его величина может достигать нескольких микровольт. При температуре тела млекопитающих РРП состоит преимущественно из одной отрицательной волны (R₂-компонент). Снижение температуры сопровождается появлением еще одного компонента противоположного направления (R₁), который предшествует R₂-волне, - форма РРП становится бифазной (рис. 5). Не вызывает сомнений, что РРП возникает как следствие смещения зарядов в фоторецепторной мембране в процессе фотолиза родопсина (см. следующий раздел). R₁-компонент РРП устойчив к температуре и может быть зарегистрирован при ее снижении даже до -35°С. Появляется этот компонент не позднее, чем стадия фотолиза батородопсин-люмиродопсин. R₂-компонент чувствителен к температуре и подавляется примерно при 0° С, когда блокируется переход мета I-мета II-родопсин. Возникновение R₂-компонента РРП связывают именно с этой стадией фотолиза родопсина.

Рис.5 Ранний рецепторный потенциал. Электроретинограмма получена на изолированной перфузируемой сетчатке крысы.

РРП удается зарегистрировать не только на плазматической мембране НСП, но и на мембранах фоторецепторных дисков, фиксированных на тонких гидрофобных мембранах, или на сплошной тефлоновой пленке, покрытой родопсином. На фоторецепторных дисках амплитуда РРП в ответ на яркую вспышку может превышать 40 мВ.

Относительно функциональной роли РРП высказывались два диаметрально противоположных мнения. Согласно одному из них, РРП представляет собой эпифеномен, который не играет сколько-нибудь заметной роли в зрительной трансдукции, хотя он и обязан своим появлением процессам, участвующим в фототрансдукции. В качестве существенного аргумента в пользу этой точки зрения приводится, в частности, малая величина энергии РРП - 6,4х10^-28 Дж, что ниже на 9 порядков энергии кванта видимого света (около
4х10^-19 Дж) и на 7 порядков – энергии теплового движения (примерно 4x10^-21 Дж). Другое мнение состоит в том, что РРП, возможно, играет важную функциональную роль: появляясь вследствие фотовозбуждения родопсина,
РРП предположительно способен вызывать повышение ионной
проводимости потенциалзависимых кальциевых каналов, присутствующих в мембране фоторецепторных дисков; в результате ионы кальция выходят из внутридискового пространства (гипотетического депо Са²⁺) в цитоплазму НСП и модулируют фоторецепторный ответ. На сегодняшний день нет доказательств того, что этот механизм в действительности функционирует в фоторецепторной клетке, в частности, как будет показано ниже, факт светоиндуцированного повышения концентрации кальция в цитоплазме НСП, похоже, не подтверждается.

3.1.2. Поздний рецепторный потенциал

Поздний рецепторный потенциал (ПРП) – это и есть тот гиперполяризационный ответ фоторецептора, о котором говорилось в предыдущем разделе и который обусловлен подавлением входящего в наружный сегмент натриевого тока. Если РРП после света выявляется в миллисекундной шкале практически с нулевой латентностью, то ПРП развивается с заметной задержкой. Его продолжительность – от момента возникновения до исчезновения – составляет величину от сотен миллисекунд до нескольких секунд. Сказанное справедливо как для палочек, так и для колбочек позвоночных животных. Что касается беспозвоночных, то у них световой стимул тоже вызывает появление ПРП, но здесь – это деполяризационный, а не гиперполяризационный ответ. (В дальнейшем речь пойдет только о палочках сетчатки позвоночных животных).

ПРП – первый функционально значимый этап электрофизиологического ответа фоторецепторной клетки на световой стимул. Потенциал покоя, или темновой потенциал, на плазматической мембране палочки составляет в среднем -30 мВ (минус внутри клетки), но он может быть и выше или ниже: от -10 до -45 мВ в зависимости от вида животного. Величина вызванной светом гиперполяризации плазматической мембраны, т.е. амплитуда ПРП, может достигать примерно 40 мВ. При фотовозбуждении единичной молекулы родопсина, присутствующей в одном из фоторецепторных дисков, наблюдается локальное изменение проводимости (и соответственно потенциала) плазматической мембраны в ее участке, соседствующем с данным диском. Исходно ширина такой полосы составляет несколько микрометров, но затем изменение потенциала быстро распространяется по всей клеточной мембране в виде пассивного перераспределения заряда. При этом свойства плазматической мембраны таковы, что распространение ПРП от НСП к внутреннему сегменту происходит без значительного ослабления. Достигнув синаптического окончания, гиперполяризационная волна модулирует скорость секреции нейромедиатора в синаптическую щель. Интересно, что и здесь фоторецепторная клетка ведет себя не так, как обычные нейроны. В "нормальных" нервных клетках возбуждение сопровождается деполяризацией мембраны аксона и стимуляцией секреции нейромедиатора в пресинаптическое окончание. В фоторецепторе же в состоянии покоя происходит постоянное выделение нейромедиатора из синаптического окончания, тогда как при возбуждении клетки и гиперполяризации ее плазматической мембраны секреция нейромедиатора подавляется.

Рис. 6. Поздний рецепторный потенциал (схема)

Форма графика изменения потенциала на плазматической мембране НСП во времени в ответ на вспышку света показана на рис. 6. На темноадаптированных палочках эти изменения могут быть зарегистрированы даже при поглощении единственного фотона на клетку. Возрастание числа поглощенных квантов ориентировочно до 30 на темноадаптированный фоторецептор сопровождается линейным увеличением амплитуды ответа. При дальнейшем росте интенсивности вспышек наблюдается отклонение от линейной зависимости, и при световом потоке, равным приблизительно 100 или более фотонам на клетку, достигается насыщение ответа. График зависимости амплитуды ответы (А) от интенсивности световой вспышки (И) представляет собой гиперболу и может быть удовлетворительно описан уравнением, аналогичным уравнению Михаэлиса: А = А_макс.хИ/И+К, где А_макс. – максимальная амплитуда при насыщении ответа, К – интенсивность света, вызывающая 50%-ный ответ. Таким образом, гемноадаптированная палочка может работать в режиме счетчиков квантов, перекрывая диапазон интенсивности светового потока примерно в две логарифмические единицы.

3.1.3. Световая адаптация

Глаз позвоночных животных способен различать изменения интенсивности света в колоссальном диапазоне – около 8 логарифмических единиц; большая часть этой способности связана с существованием в сетчатке фоторецепторных клеток двух типов: палочек и колбочек. Но и сами палочки могут успешно функционировать в диапазоне, который перекрывает около 6 порядков интенсивности светового потока, благодаря явлению, получившему название световой адаптации. Для его обозначения используются также термины "фоновая (background) адаптация" и десенситизация.

Если начать освещать сетчатку постоянным светом, то временная гиперполяризация сменится постепенным возвращением мембранного потенциала к исходному темновому уровню, но не до конца: потенциал покоя, на постоянном свету будет несколько более отрицательным, чем темновой потенциал. При освещении фоторецепторов вспышками света возрастающей интенсивности на фоне постоянной подсветки будет наблюдаться, как и в случае темноадаптированных палочек, гиперболическая зависимость амплитуды рецепторного потенциала от интенсивности вспышки. Но здесь, по сравнению с темноадаптированными фоторецепторами, для получения той же амплитуды ответа потребуются тем более интенсивные вспышки, чем сильнее фоновое освещение. Аналогичная картина может быть получена и без фонового освещения, если ответ фоторецепторных клеток на тестовую световую вспышку измеряется после предшествующей ей вспышки, как бы выполняющей роль светового фона. Таким образом, фоновое освещение или предварительная импульсная вспышка снижают чувствительность фоторецепторной клетки к световому стимулу.

Весьма существенно, что даже очень слабое фоновое освещение способно вызывать снижение чувствительности, много больше того, которое можно было бы ожидать, исходя из нелинейности фоторецепторного ответа. Например, фоновое освещение, по своей интенсивности лишь немного превышающее пороговую величину для темноадаптированной палочки, вызывает 50%-ное уменьшение ее ответа на последующую вспышку. То, что значительное падение чувствительности фоторецепторов происходит уже при слабом фоновом освещении, говорит о малом вкладе, который вносит в световую адаптацию снижение концентрации родопсина, обусловленное его обесцвечиванием под действием квантов светового фона; этот вывод подтверждается и другими экспериментальными данными. Однако ответ на вопрос, какие именно механизмы лежат в основе световой адаптации, до сих пор не получен.

3.1.4. Темновая адаптация

При реально существующих освещенностях, которым соответствует нормальный физиологический ответ сетчатки, в фотовозбужденном состоянии оказывается лишь незначительная много меньшая 1% доля родопсина в сравнении с его общим количеством, присутствующим в палочках. Однако длительное пребывание на очень ярком свету может привести к заметному снижению в сетчатке количества "работоспособных", т.е. незасвеченных молекул пигмента и, как следствие, - к падению чувствительности глаза. При последующем переходе к темновым условиям будет происходить постепенное восстановление чувствительности фоторецепторных клеток, требующее довольно длительного времени (порядка нескольких минут и более). Это восстановление сниженной на ярком свету чувствительности фото рецепторов в темноте и носит название темновой адаптации.

Существует еще один эффект также выражающийся в восстановлении чувствительности фоторецепторных клеток после освещения. Но он, в отличие от темновой адаптации, выявляется не после прекращения действия света, а наоборот – при достаточно длительном фоновом освещении не чрезмерной интенсивности. Сначала, как уже было сказано, фоновый свет вызывает снижение чувствительности фоторецепторов (световая адаптация), но при более длительном его воздействии наблюдается частичное восстановление чувствительности клеток. Этот эффект назван "выход из состояния десенситизации", но можно предложить и более удобный термин – "ресенситизация".

3.2. Фототрансдукция

Как плазматическая мембрана палочки, отвечая гиперполяризацией на световой стимул, узнает о том, что родопсин, локализованный в фоторецепторных дисках, поглотил квант света? Этот вопрос вытекает уже из того морфологического факта, что практически весь родопсин НСП сосредоточен в фоторецепторных дисках, пространственно отделенных от плазматической мембраны.

Существует ряд электрофизиологических данных, которые свидетельствуют в пользу того, что указанная проблема решается в фоторецепторной клетке с помощью посредника (трансмиттера), отвечающего за передачу сигнала от фотовозбужденного родопсина к плазматической мембране. Так, выше уже упоминалось (см. разд. 2.3.2), что поглощение единственного кванта света приводит к закрытию сотен натриевых каналов в плазматической мембране НСП. Из анализа флуктуаций амплитуды ответа на слабые вспышки света при записи тока через плазматическую мембрану или потенциала на ней следует, что фотоизомеризация каждой молекулы родопсина сопровождается появлением минимум сотен частиц, которые блокируют проводимость мембраны. О наличии сложного механизма передачи сигнала от фоторецепторных дисков к плазматической мембране НСП говорит и следующий факт: кривая изменения тока через плазматическую мембрану в ответ на световую вспышку хорошо описывается уравнением, которое предполагает, что поглощение фотона инициирует серию последовательных событий, вызывающих в конечном счете изменение проводимости мембраны НСП.

Этот механизм обеспечивает примерно 100000-кратное усиление исходного сигнала: энергия кванта видимого света (длина волны 500 нм) составляет 2,5 эВ, а работа, совершаемая при переносе суммарного электрического заряда через плазматическую мембрану (потенциал покоя -30 мВ) в расчете на один фотон равна 2 х 10⁵ эВ.

Поскольку химическая природа посредника, строго говоря, до сих пор не установлена, хотя его существование и не вызывает сомнений, можно сказать, что он был "вычислен" на основании данных по морфологии и электрофизиологии фоторецепторной клетки. Относительно его природы высказывались различные гипотезы, причем как наиболее вероятные в течение »лее чем десятка лет рассматривались две из них: "кальциевая" и "цикломононуклеотидная". Однако экспериментальные последних лет поставили кальциевую гипотезу под серьезное сомнение и, напротив, резко увеличили шансы цикломононуклеотидной гипотезы.

3.2.1. Кальциевая гипотеза

Кальциевая гипотеза, впервые высказанная Yoshikami и Yagins, предполагает, что внутридисковое пространство выполняет функцию депо для ионов кальция; освещение инициирует выход кальция из дисков; повышение концентрации катиона в цитоплазме НСП приводит к блокированию натриевых каналов в плазматической мембране палочки; существует механизм, обеспечивающий обратное закачивание кальция во внутридисковое пространство. В пользу этой гипотезы свидетельствовала, прежде всего, способность ионов кальция подавлять натриевую проводимость плазматической мембраны палочки, продемонстрированная на целой сетчатке или на препаратах НСП. Однако остальные положения кальциевой гипотезы либо не нашли своего подтверждения, либо строго не доказаны.

По разным оценкам, содержание кальция в фоторецепторных дисках составляет 0,07-0,43 г-атома на моль родопсина, хотя пул способного к обмену катиона оценивается менее чем в 10% от его общего содержания в фоторецепторных дисках. Кроме того, нельзя с уверенностью утверждать, что этот кальций заключен во внутридисковом пространстве, а не связан на поверхности дисков.

Многочисленные попытки выявить быстрый светозависимый выброс кальция из фоторецепторных дисков не дали положительного результата: в большинстве работ был зарегистрирован медленный выход порядка одного катиона или менее в расчете на молекулу фотовозбужденного родопсина; также не определены данные относительно механизмов, обеспечивающих реаккумуляцию Са²⁺ в диски. Исключение составляет работа, выполненная на фоторецепторных дисках в составе частично разрушенных НСП, где получен "рекордный" выход кальция: до 500 катионов на диск на ярком свету Но и здесь скорость высвобождения кальция из дисков и его количество в расчете на один фотон были много ниже того, которое следовало бы ожидать, если бы Ca²⁺ выполнял функцию посредника; кроме того, возможна иная интерпретация этих данных, согласно которой наблюдаемый в цитируемой работе повышенный выход кальция из дисков – на самом деле кажущийся.

Проблема со светозависимым выбросом кальция из фоторецепторных дисков и его реаккумуляцией в темноте снимается, если предположить, что светочувствительным кальциевым депо служит не внутридисковое пространство, а цитоплазма НСП. Но и в этом случае следует ожидать повышения концентрации свободного кальция в цитоплазме НСП после освещения, чего в действительности, как это было недавно показано, не происходит.

На самом деле на ярком свету уже после того, как проводимость плазматической мембраны полностью подавлена, и, следовательно, катионы (Na⁺ и Ca⁺) перестают поступать в цитоплазму, выброс кальция из НСП продолжается, т.к. Na⁺/Ca²⁺-обменник вскоре прекращает свою работу. Существенно, что снижение концентрации свободного цитоплазматического кальция, обусловленное его быстрым выходом из НСП, не успевает скомпенсироваться за счет присутствующего в цитоплазме связанного катиона, т.е. в НСП равновесие между свободным и связанным кальцием устанавливается достаточно медленно.

Таким образом, вне зависимости от того, где локализован связанный кальций – в фоторецепторных дисках или вне их, - свет индуцирует не повышение, а понижение концентрации свободного катиона в цитоплазме НСП, и этот факт, очевидно, можно считать решающим аргументом против кальциевой гипотезы фототрансдукции.

Существует еще целый ряд данных, противоречащих кальциевой гипотезе; они достаточно подробно рассмотрены и обсуждены в обзорах. Заметим лишь еще раз, что кальций не способен блокировать катионные каналы в экспериментах на изолированных препаратах плазматической мембраны НСП при добавлении с ее цитоплазматической стороны (см. раздел 2.3.2.), и, следовательно, эффект подавления катионной проводимости плазматической мембраны ионами Ca²⁺, продемонстрированный на целой сетчатке и суспензии НСП, не связан, скорее всего, с прямым действием кальция на мембрану, а чем-то опосредован. Вполне вероятно, что точкой приложения для действия кальция служат ферменты метаболизма cGMP, который в настоящее время рассматривается как наиболее вероятный кандидат на роль посредника между фотовозбужденным родопсином и натриевыми каналами плазматической мембраны НСП.

3.2.2. Гипотеза об участии cGMP в передаче сигнала в фогорецепторной клетке

Гипотеза о том, что свет может регулировать концентрацию циклического нуклеотида в НСП, впервые высказанная в 1971 году Bitensky и Miller, возникла на волне интереса к сАМР. К тому времени уже было установлено, что клеточная концентрация этого ключевого циклического нуклеотида у эукариотов регулируется гормонами через аденилатцц" лазный комплекс. Тем самым впервые была проведена аналогия между светом и гормонами как первичными сигналами, регулирующими клеточный метаболизм. Первоначально предполагалось, что свет ингибирует активность фоторецепторной аденилатциклазы, а не активирует ФДЭ, которая рассматривалась тогда лишь как фермент, выполняющий вспомогательную функцию приведения концентрации циклического нуклеотида к норме после прекращения действия стимула. Позднее были получены многочисленные подтверждения участия циклического нуклеотида в формировании фоторецепторного ответа, но этим нуклеотидом оказался не cAMP, a cGMP.

Мы не будем подробно останавливаться на всех имеющихся данных такого рода, а ограничимся кратким их обзором. В противном случае пришлось бы в значительной мере продублировать обстоятельный и критический обзор, уже сделанный в недавней монографии Волотовского и Конева; современное состояние вопроса проанализировано также в свежем обзоре Pugh и Cobbs.

Итак, в палочках был обнаружен аномально высокий уровень cGMP - порядка 50-70 мкМ (см. раздел 2.2.3) и найдены ферменты его метаболизма, прежде всего ФДЭ и гуанилатциклаза; удалось продемонстрировать светозависимую активацию ФДЭ и показать, что свет может регулировать концентрацию cGMP в фогорецепторной клетке, а также то, что светозависимая активация ФДЭ происходит в субсекундные времена, причем поглощение родопсином единственного кванта света сопровождается быстрым, в течение сотен миллисекунд, гидролизом до 10⁵ молекул cGMP.

Выяснилось, что передачу сигнала от фотовозбужденного родопсина к ФДЭ опосредует специальный GTP-связываюшй белок, названный трансдуцином, и каждая молекула активированного светом родопсина катализирует GDP/GTP—обмен на сотнях молекул трансдуцина. В регуляции передачи этого сигнала участвуют специфичная в отношении родопсина протеинкиназа – родопсинкиназа – и, по-видимому, фоторецепторный белок с молекулярной массой 48 кД. Существенно, что на белки, участвующие в передаче сигнала от фотовозбужденного родопсина к ФДЭ и в ее регуляции приходится (без учета родопсина) большая часть массы всех экстрагируемых белков НСП (см. раздел 2.2.2).

Большая группа экспериментальных фактов свидетельствует о том, что повышение внутриклеточной концентрации cGMP путем его инъекции в фоторецепторную клетку или нанесение каким-либо способом на плазматическую мембрану сопровождается увеличением ее натриевой проводимости и деполяризацией, а в некоторых случаях – возрастанием латентности фоторецепторного ответа. К увеличению натриевой проводимости мембраны НСП приводит также введение в фоторецептор негидролизуемого аналога cGMP или изобутилметилксантина - конкурентного ингибитора ФДЭ. При этом весьма вероятно, что наблюдаемые эффекты связаны с прямым действием cGMP на проводимость светозависимых катионных каналов, присутствующих в плазматической мембране фоторецепторной клетки, о чем свидетельствуют эксперименты Фесенко и соавт., а также результаты некоторых других работ.

Из совокупности приведенных данных логично предположить следующую последовательность событий, лежащих в основе фототрансдукции: квант света инициирует фотолиз родопсина; фотовозбужденный родопсин активирует трансдуцин; ФДЭ активизируется трансдуцином и интенсивно гидролизует cGMP; понижение внутриклеточной концентрации циклического нуклеотида приводит к диссоциации связанного с плазматической мембраной сСМР; катионные каналы, "потерявшие" нуклеотид, закрываются; натриевая проводимость мембраны снижается, и она гиперполяризуется.

Однако следует сказать и о тех экспериментальных данных, которые не вполне согласуются с этой схемой.

Значительное, порядка десятков процентов падение концентрации cGMP, индуцированное светом, было неоднократно зарегистрировано как на разного рода препаратах НСП, так и на целой сетчатке, но при том условии, что в экспериментах, как правило, использовались очень интенсивные, намного превосходящие физиологический уровень световые вспышки; либо требовалось длительное освещение препаратов; либо концентрация ионов Са²⁺ в исследуемых пробах была на несколько порядков меньше физиологической: 10^-8 М и ниже. В условиях же быстрой фиксации срезов сетчатки после слабого освещения при обычных концентрациях кальция не удается выявить статистически достоверных изменений концентрации cGMP в препаратах за времена, сравнимые с продолжительностью фоторецепторного ответа. В одном случае заметное снижение уровня cGMP в препаратах сетчатки проявлялось через 5 секунд после слабого освещения, в другом для этого требовалось трехсекундное яркое освещение.

Поэтому, несмотря на многочисленные данные, свидетельствующие о вовлечении cGMP в прямой путь передачи сигнала от фотовозбужденного родопсина к плазматической мембране фоторецепторной клетки, в настоящее время приходится все же рассматривать две альтернативные возможности: 1) светоиндуцированные изменения концентрации cGMP действительно модулируют катионную проводимость плазматической мембраны в процессе фоторецепторного ответа, но они при физиологических условиях, почему-то не выявляются; 2) эти изменения хотя и имеют место, но проявляются лишь через несколько секунд на достаточно ярком свету, а в субсекундные времена незначительны и не имеют прямого отношения к передаче сигнала от фотовозбужденного родопсина к плазматической мембране.

Каким образом может быть реализована первая из этих возможностей? Наиболее привлекательное объяснение, на наш взгляд, сводится к тому, что в НСП существуют, как минимум, два пула сСМР: меньший, представленный свободным нуклеотидом, и больший – прочно связанный, причем лишь свободный cGMP отвечает понижением концентрации на световую вспышку. О том, что концентрация свободного cGMP в НСП много ниже его общей концентрации, уже говорилось в разделе 2.2.3. На это же указывают данные работы, согласно которым действию света доступны только 15% от общего количества cGMP в НСП, и кроме того – обнаружение центров связывания с высоким средством к cGMP в палочках. Высказывалось также предположение, что слабая световая вспышка вызывает лишь локальные изменения концентрации cGMP не измеримые на общем фоне нуклеотида в цитоплазме НСП, но, тем не менее, "ощутимые" для плазматической мембраны фоторецепторной клетки.

Вторая из названных возможностей (в физиологических условиях светоиндуцированные изменения уровня cGMP в НСП незначительны и не имеют отношения к передаче сигнала от фотовозбужденного родопсина к плазматической мембране) рассматривается в работах, выполненных на интактных сетчатках кролика при относительно слабом освещении. Главный результат этих работ, в которых измерялась скорость метаболизма cGMP в НСП (по включению ¹⁸О из H₂¹⁸Oза-фосфорильный остаток остаток гуаниловых нуклеотидов), заключается в том, что свет стимулирует метаболический поток cGMP более чем в 4 раза, приводя к дополнительному гидролизу - синтезу примерно 10 000 молекул cGMP на каждый поглощенный фотон. Метаболический поток cGMP обеспечивается расходом 1,7 ммоля эквивалентов АТР в минуту; он варьируется в том же диапазоне интенсивностей света и "включается - выключается", как минимум, с той же скоростью, что и элктрофизиологический ответ фоторецепторной клетки. Гидролиз cGMP катализирует светозависимая ФДЭ, его синтез - гуанилатциклаза, активность которой не чувствительна к свету и регулируется каким-то иным образом, возможно, ионами кальция.

Авторы предполагают, что светозависимый гидролиз cGMP не способ понижения концентрации циклического нуклеотида в физиологических условиях, а лишь часть механизма регуляции его метаболического потока в фоторецепторной летке. Однако они не предлагают объяснения того, каким образом изменения скорости синтеза-гидролиза cGMP могли бы оказывать влияние на проводимость плазматической мембраны НСП. Во всяком случае, образующиеся при гидролизе cGMP продукты – протоны и 5'-GMP не оказывают прямого действия на проводимость плазматической мембраны фоторецепторной клетки.

Мы не будем рассматривать другие гипотезы фототрансдукции: как правило, они используют в той или иной комбинации ионы кальция и cGMP в качестве участников механизма передачи сигнала в фоторецепторной клетке. Заметим лишь в заключение, что вне зависимости от дальнейшей судьбы цикломононуклеотидной гипотезы важность cGMP для функции фоторецепторной клетки очевидна хотя бы потому, что большая часть экстрагируемых белков НСП так или иначе имеет отношение к светорегулируемому метаболизму этого циклического нуклеотида. Тем не менее, функциональное и, как будет показано далее, также и структурное сходство цепи передачи сигнала "гормон → рецептор → GTP-связывающий белок → аденилатциклаза → сАМР → мишень", типичной для многих эукариотических клеток, и цепи "свет → родопсин → трансдуцин → ФДЭ → cGMP → натриевый канал" позволяет надеяться, что фосфодиэстеразный каскад все же представляет собой прямой путь передачи сигнала в фоторецепторной клетке.

В последующих разделах будут подробно рассмотрены главные участники этого каскада: родопсин, GTP-связывающий белок трансдуцин и светозависимая ФДЭ, а также основные механизмы его регуляции.

4. РОДОПСИН

Зрительный пигмент палочек сетчатки позвоночных родопсин, открытый в 1877 г. Kuhne, представляет собой интегральный мембранный белок с молекулярной массой 39 кД. Родопсин – основной компонент фоторецепторной мембраны, хромофором в нем служит 11-цис-ретиналь, связанный с ε-аминогруппой лизина посредством протонированного шиффова основания.

4.1. Фотохимия родопсина

По предложенной Wald классификации все известные зрительные пигменты могут быть разделены на два типа: первые из них – родопсины – содержат в качестве хромофора 11-цис-региналь, вторые - порфиропсины – 11-цис-3,4-диде-гидроретиналь. Максимумы поглощения родопсинов в видимой области спектра варьируют у разных животных в пределах от 345 до 575 нм (например, у родопсина из палочек сетчатки быка 498 нм), а порфиропсинов – от 338 до 620 нм. Эти различия в положении максимума поглощения определяются белковым окружением хромофорной группы. Характерно, что один и тот же опсин может связываться как с 11-цис-ретиналем, так и с его 3,4-дидегидропроизводным.

Основной максимум поглощения 11-цис-ретиналя находится около 380 нм. Его присоединение к белковой молекуле сопровождается значительным смешением максимума поглощения в длинноволновую область спектра. Батохромный сдвиг до 440 нм можно наблюдать в модельной системе при образовании протонированного шиффова основания между молекулами ретиналя и бутиламина. Дальнейший длинноволновый сдвиг обусловлен вторичными взаимодействиями между хромофором и его белковым микроокружением.

Поглощение родопсином кванта света приводит к ряду фотохимических превращений – фотолизу, - продуктами которой являются полностью-транс-ретиналь и опсин. Собственно фотохимический процесс – стадия 11-цис → 11-транс-изомеризации ретиналя в составе хромофорной группы родопсина. Все остальные стадии фотолиза – темновые, они сопряжены с конформационными перестройками в молекуле родопсина и реакциями протонирования-депротонирования шиффова основания между ретиналем и ε-аминогруппой лизинового остатка опсина. На рис. 7 суммированы выявленные с помощью низкотемпературной спектрофотометрии и лазерного флеш-фотолиза основные интермедиаты фотохимических превращений родопсина, которые могут быть обнаружены как in vivo, так и in vitro.

Рис. 7. Схема фотолиза родопсина. На схеме указаны значения спектральных максимумов полос поглощения промежуточных продуктов фотолиза, время их жизни при комнатной температуре и температуры, при которых осуществим каждый из переходов.

Наибольшую важность для биохимических реакций, приводящих к возникновению фоторецепторного ответа, представляют интермедиаты, образующиеся на заключительных стадиях обесценивания родопсина, и среди них, в первую очередь, - мета-родопсинII. Появление этого интермедиата при комнатной температуре наблюдается примерно через 10^-3 сек после поглощения родопсином кванта света и сопровождается значительными конформационными перестройками в молекуле белка, о которых можно судить по переходу одного из остатков триптофана из гидрофобного окружения в водную фазу, приобретению шиффовым основанием способности взаимодействовать с боргидридом натрия и появлению доступности остатков и цистеина³²³ к действию модифицирующих реагентов. Образование метародопсина II сопровождается также падением светорассеяния суспензии фоторецепторных мембран и приобретением родопсином способности связывать трансдуцин и родопсинкиназу. С образованием метародопсина II связано и нарастание основной фазы [R₂] раннего рецепторного потенциала, в основе которого лежит перемещение электрического заряда в молекуле родопсина.

В соответствии с наиболее общепринятой точкой зрения, основанной на анализе спектров резонансного комбинационного рассеяния продуктов фотолиза родопсина, образование метародопсина II сопровождается депротонированием альдиминной связи полностью-транс-ретиналя с ε-аминогруппой лизина²⁹⁶.

Одновременно с депрогонированием шиффова основания при переходе метародопсин I → метародопсин II еще несколько ионизируемых групп в молекуле родопсина отщепляют и присоединяют протоны. В результате образование метародопсина II сопровождается поглощением одного или двух протонов из среды. В этом смысле можно провести аналогию между родопсином и бактериородопсином. Различие же в работе этих белков сводится к тому, что в случае бактериородопсина протон освобождается на противоположной стороне мембраны, а в случае зрительного родопсина этого не происходит.

На рис. 7 видно, что метародопсин II находится в равновесии с метародопсином I, которое чувствительно к температуре и рН среды. Это равновесие сдвигается в сторону образования метародопсина II при повышении температуры и снижении рН (рис. 8).

Рис.8. Трехмерная диаграмма зависимости равновесия метародопсин I « метародопсин II от температуры и pH.

Время жизни метародопсина II при 37° С составляет около 100 сек. Его распад в опсин и полностыо-транс-ретиналь может происходить как напрямую, так и через образование метародопсина III, причем в физиологических условиях второй путь является предпочтительным.

Конечный продукт фотолиза родопсина – опсин – может быть вновь регенерирован в родопсин в темноте в присутствии 11-цис-региналя. Образование связи между опсином и ретиналем происходит самопроизвольно и не требует наличия каких-либо дополнительных факторов. При регенерации родопсина in vitro 11-цис-ретиналь быстро изомеризуется в смесь 13-цис- и полностью-транс-ретиналей под действием присутствующего в фоторецепторных мембранах фосфатидилэтаноламина, поэтому наиболее полная регенерация наблюдается в результате последовательного добавления небольших порций 11-цис-ретиналя к суспензии мембран. Способностью взаимодействовать с опсином in vitro обладает также 9-цис-ретиналь; в этом случае образуется изородопсин, имеющий максимум поглощения при 485 нм. Полностью-транс- и 13-цис-изомеры ретиналя не могут ковалентно связываться с опсином.

4.2. Структура родопсина

4.2.1. Аминокислотная последовательность родопсина

Полная аминокислотная последовательность родопсина была впервые определена Овчинниковым и соавторами. Полученные результаты были впоследствии подтверждены при определении нуклеитидной последовательности гена родопсина, а также при установлении аминокислотной последовательности ряда его пептидов. Молекула родопсина (рис. 9 см. вкладку) состоит из 348 аминокислотных остатков, в число которых входят остатки всех 20 главных аминокислот включая цистеин и гистидин, сравнительно редкие для мембранных белков. N-Концевой участок молекулы ориентирован во внутридисковое пространство, C-концевой – в цитоплазму НСП. Как уже было отмечено, в образовании связи с 11-цис-ретиналем принимает участие лизин²⁹⁶; 2-й и 15-й остатки аспарагина ковалентно связаны с олигосахаридными цепями одинакового состава, имеющими молекулярную массу 2114. Замечательным свойством этих цепей оказалась их способность связываться с конканавалином А, благодаря чему был разработан удобный и эффективный способ очистки и делипидизации родопсина при помощи аффинной хроматографии на конканавалин-А-сефарозе. Так как родопсин является практически единственным гликопротеидом, входящим в состав НСП, то после растворения фоторецепторных мембран в присутствии детергента и нанесения раствора на колонку с конканавалин-А-сефарозой, родопсин оказывается единственным связанным с носителем компонентом смеси. Элюция родопсина обычно проводится в присутствии α-метил-маннопиранозида, вытесняющего белок из комплекса с конканавалином А.

4.2.2. Топография молекулы родопсина в фоторецепторной мембране

Установление первичной структуры родопсина легло в основу выяснения способа укладки его полипептидной цепи в мембране. Теоретический анализ показал, что в аминокислотной последовательности родопсина продолжительные участки, состоящие преимущественно из остатков неполярных аминокислот, сменяются более короткими фрагментами, содержащими гидрофильные остатки. Учитывая более ранние свидетельства в пользу того, что внутримембранная часть молекулы родопсина представлена α-спиральными структурами, ориентированными перпендикулярно поверхности мембраны, а также тот факт, что средняя протяженность гидрофобных сегментов составляет 26 аминокислотных остатков, которые, будучи организованы в виде α-спирали, имеют протяженность, равную толщине мембранного бислоя, была предложена модель, в соответствии с которой молекула родопсина "прошнуровывает" мембрану семь раз. Согласно этой модели, около 50% массы молекулы родопсина погружено в толщу мембраны и примерно по 25% - экспонировано во внутридисковое пространство и в цитоплазму НСП. Наиболее протяженные внемембранные участки молекулы - это N- и C-концевые последовательности.

Гипотеза о том, что полипептидная цепь родопсина пересекает мембрану семь раз, предполагает, что между внутримембранными α-спиральными участками молекулы находятся гидрофильные последовательности, экспонированные поочередно то на внутридисковой, то на цитоплазматической поверхности мембраны. Поэтому экспериментальная проверка гипотезы о "семи столбах" проходила в направлении поиска участков молекулы родопсина, которые доступны для действия протеиназ или способны связывать моноклональные антитела на родопсин при исследовании на суспензии фоторецепторных мембран. В результате этих экспериментов были определены 3 из 8 предполагаемых последовательностей, экспонированных на поверхности мембраны. Три из них ориентированы во внутридисковое пространство: а) N-концевой фрагмент молекулы, состоящий из 30 аминокислотных остатков, который может быть отщеплен химотрипсином; б) участок лейцин⁹⁵ – глутамат¹¹³ между 2-м и 3-м α-спиральными сегментами, обладающий способностью связывать моноклональные антитела; в) последовательность тирозин¹⁷⁸ – метионин²⁰⁷ между 4-м и 5-м α-спиральными сегментами, также выявленная с помощью антител (в этом же фрагменте находится связь между серином¹⁸⁶ и цистеином¹⁸⁷, доступная для папаина).

Еще три последовательности экспонированы на цитоплазматической стороне фоторецепторного диска: а) C-концевой фрагмент их 26 аминокислотных остатков, который может быть отщеплен папаином (он обладает также способностью связывать моноклональные антитела); б) участок глутамин²³⁶ – лизин²⁴⁵ между 5-м и 6-м α-спиральными сегментами, содержащий несколько связей чувствительных к действию различных протеиназ; в) последовательность тирозин¹³⁶ аргинин¹⁴⁷ между 3-м и 4-м α-спиральными сегментами, выявленная при помощи моноклональных антител (здесь же находится связь фенилаланин¹⁴⁶ – аргинин¹⁴⁷, доступная для гидролиза химотрипсином).

Таким образом, для окончательного доказательства гипотезы об укладке полипептидной цепи родопсина в мембране в виде 7-ми α-спиральных сегментов, остается показать, что участок между 1-м и 2-м α-спиральными сегментами экспонирован в цитоплазму НСП, а участок между 6-й и 7-й α-спиралями – во внутридисковое пространство. Из модели на рис. 9 видно, что эти участки относятся к числу наиболее коротких гидрофильных последовательностей в молекуле родопсина, с чем, по-видимому, и связаны трудности, возникающие при исследовании их локализации.

Способ укладки мембранных белков в виде семи α-спиральных сегментов, скорее всего, не уникален для родопсина и бактериородопсина. Аналогичная вторичная структура была предсказана для одного из компонентов фотосистемы II в хлоропластах и β-адренергического рецептора. Первая из этих работ озаглавлена: "Является ли структура в виде семи спиральных тяжей общей для интегральных мембранных белков?". Учитывая большой интерес исследователей к структуре мембранных белков, можно ожидать, что ответ на этот вопрос будет получен в недалеком будущем.

4.2.3. Третичная структура родопсина

Выяснение третичной структуры родопсина имеет принципиальное значение для понимания механизмов его функционирования. Обычный в таких случаях подход, использующий рентгеноструктурный анализ, для родопсина применить не удалось, поскольку до сих пор не получен трехмерный кристалл этого белка, и причина неудачи кроется, прежде всего, в высокой гидрофобности молекулы родопсина. В связи с этим однозначный ответ на вопрос о пространственном расположении спиральных сегментов в молекуле родопсина в настоящее время отсутствует, а в литературе рассматриваются лишь гипотетические модели его третичной структуры.

Одна из таких моделей была предложена в работе, где был использован опыт, накопленный при установлении пространственной структуры бактериородопсина. При построении модели авторы исходили из того, что α-спиральные сегменты формируют полость, в которой расположен 11-цис-ретиналь, причем наиболее гидрофобные поверхности α-спиральных тяжей контактируют с жирнокислотными цепями мембранных фосфолипидов, а полярные аминокислотные остатки ориентированы внутрь молекулы. Естественно, внутрь молекулы должен быть ориентирован и остаток лизина²⁹⁶, с которым связан ретиналь. Полученная таким образом модель предполагает, что α-спиральные сегменты расположены в толще мембраны в два рядв. В одном из которых находятся первые четыре сегмента, o втором – оставшиеся три (рис. 10). Открытым на сегодняшний день остается и вопрос о пространственном расположении ретиналя в молекуле родопсина. В обзорах суммированы данные об участии отдельных аминокислотных остатков во взаимодействии с ретиналем в формировании батохромного сдвига. Представляется наиболее вероятным, что с ретиналем взаимодействуют остатки риптофана²⁶⁵, гистидина²¹¹, а также один или два из остатков аспартата⁸³, глутамата¹¹³ и глутамата¹²². Изучение связывания с родопсином различных аналогов хромофора показало, что длина ретинальсвязывающего участка в белке вставляет 10,1-10,9 Å.

По данным разных авторов, вектор переходного дипольного момента остатка 11-цис-ретиналя в родопсине образует угол 11°-18° с плоскостью мембраны, то есть ретиналь расположен практически параллельно поверхности фоторецепторного диска. Происходящая при обесцвечивании родопсина цис-транс-изомеризация ретиналя вызывает уменьшение этого угла до 0° и изменение положения атома азота боковой цепи лизина²⁹⁶ на 4-5 Å, но практически не приводит к смещению β-ионового кольца остатка ретиналя. Все предложенные модели укладки полипептидной цепи родопсина в мембране предполагают, что остаток лизина²⁹⁶, образующий протонированное шиффово основание с ретиналем, расположен в середине 7-го трансмембранного сегмента. Отсюда следует, что хромофор расположен на одинаковом расстоянии от внутренней и внешней поверхностей фоторецепторного диска. Этот вывод был подтвержден данными по безызлучательному переносу энергии с ионов тербия на остаток ретиналя родопсина. Однако в недавно опубликованной работе, в которой выяснялось расположение хромофора относительно цитоплазматической поверхности мембраны фоторецепторного диска с помощью метода гигантского комбинационного рассеяния, традиционная точка зрения на локализацию ретиналя пересмотрена. В этом исследовании показано, что альдимин ретиналя необесцвеченного родопсина находится на расстоянии 5-10 Å, а обесцвеченного родопсина - 1-6 Å от фотоплазматической поверхности мембраны. Кроме того, проведенный авторами пересчет данных работы по безызлучательному переносу энергии при условии корректного учета суммы использованных в этой работе везикул, также показывает, что хромофор в молекуле родопсина сближен с цитоплазматической поверхностью фоторецепторного диска.

Рис. 10. Модель третичной структуры родопсина. На N-конце указаны участки гликозилирования, на С- конце фосфорилирования.

Вывод о локализации хромофора у цитоплазматической поверхности диска имеет два важных следствия. Во-первых, возникает необходимость пересмотреть вопрос о расположении в мембране 7-го α-спирального сегмента, и, во-вторых, появляется возможность того, что происходящее при фотоизомеризации ретиналя разделение зарядов вблизи альдиминной связи может служить непосредственной причиной приобретения родопсином способности взаимодействовать с цитоплазматическими белками НСП.

Вопрос о локализации дисульфидных связей в молекуле родопсина можно отнести к числу немногих однозначно решенных вопросов, касающихся третичной структуры этого белка. Данные о расположении в родопсине дисульфидных связей и свободных SH-групп, доступных для действия модифицирующих реагентов, суммированы в работах. Всего в молекуле родопсина содержится 10 остатков цистеина. Два из них - 140-й и 316-й - доступны для модификации алкилирующими реагентами, добавляемыми с цитоплазматической стороны фоторецепторного диска. Еще два - 185-й и 187-й - доступны для модификации со стороны внутридискового пространства.110-й и 167-й цистеиновые остатки образуют дисульфидный мостик, соединяющий 3-й и 4-й трансмембранные сегменты молекулы. Еще одна дисульфидная связь образуется между двумя соседними остатками цистеина - 322-м и 323-м. Характерное свойство этой связи заключается в том, что она выявляется только у необесцвеченного родопсина. Обесцвечивание приводит к ее разрыву, в результате чего 322-й и 323-й остатки становятся доступными для модификации.

4.2.4. Молекулярно-генетический подход к изучению структуры зрительных пигментов

Исследования первичной структуры зрительных пигментов, основанные на использовании молекулярно-генетических подходов, которые заключаются в выделении и секвенировании генов, кодирующих эти пигменты, обладают двумя существенными методическими преимуществами. Во-первых, этот путь менее трудоемок, чем непосредственное секвенирование белковой молекулы, во-вторых, он не требует выделения значительных количеств гомогенного препарата белка, что позволяет проводить определение аминокислотной последовательности малодоступных зрительных пигментов, например, пигментов из палочек и колбочек человека.

Выделение и секвенирование гена, кодирующего родопсин быка, подтвердило правильность проведенного ранее определения последовательности аминокислот в полипептидной цепи родопсина. Кроме того, клонирование гена бычьего родопсина послужило первым этапом для выделения генов, кодирующих все 4 зрительных пигмента человека. Авторы этих работ, исходя из того, что в нуклеотидной последовательности генов зрительных пигментов быка и человека должны наблюдаться гомологии, провели гибридизацию ДНК, кодирующей бычий родопсин, с набором из 5x10⁶ фрагментов суммарной ДНК человека. В результате были выделены фрагменты ДНК человека, хорошо гибридизующиеся с бычьей ДНК и содержащие ген родопсина из палочек, а также ряд слабо гибридизуюшихся фрагментов, в которых присутствовали гены колбочковых пигментов. Для того, чтобы определить, какие из участков полученных генов являются кодирующими, была выделена суммарная мРНК из сетчатки человека и на ее основе при помощи обратной транскриптазы получен набор комплементарных ДНК. Из этого набора выделяли ДНК, гибридизующиеся с фрагментами генов зрительных пигментов, после чего определяли их нуклеотидную последовательность Соответствующие последовательности, входящие в состав генов зрительных пигментов, представляют собой экзоны, остальные последовательности – интроны и регуляторные области.

Ген родопсина человека локализован в 3-й хромосоме и содержит в своем составе 5 экзонов и 4 интрона. В пользу того, что именно этот ген кодирует палочковый пигмент, говорит тот факт, что продукт этого гена представляет собой полипептидную цепь из 348 аминокислотных остатков, среди которых лишь 23 не совпадают с соответствующими остатками в молекуле родопсина быка. Кроме того, соответствующая этому гену мРНК присутствует в сетчатке человека в количестве, которое значительно превышает содержание мРНК, кодирующей остальные пигменты, что отражает соотношение палочковых и колбочковых пигментов в сетчатке.

Еще три гена кодируют пигменты колбочек: "синий" (λ_max = 420 нм), "зеленый" (λ_max = 530 нм) и "красный" (λ_max = 560 нм). Один из них локализован в 7-й хромосоме, остальные два – в X-хромосоме. Так как нарушения в восприятии длинноволнового света сцеплены с полом, а нарушения в восприятии синего света – нет, был сделан вывод, что ген, локализованный в 7-й хромосоме, кодирует синий пигмент. Для того чтобы установить, какой из оставшихся генов кодирует зеленый пигмент, а какой – красный, была исследована ДНК от 25 человек, страдающих нарушениями в восприятии длинноволнового света. Оказалось, что гены красного и зеленого пигментов образуют в X-хромосоме тандем, в котором присутствует одна копия гена красного и одна или несколько копий генов зеленого пигментов. При этом нарушения в цветовосприятии могут происходить как из-за отсутствия того или иного гена, так и вследствие рекомбинации генов красного и зеленого пигментов.

Ген синего пигмента, подобно гену родопсина, содержит 5 экзонов и 4 интрока и кодирует полипептидную цепь из 348 аминокислотных остатков; 42% из них идентичны соответствующим остаткам в молекуле родопсина. Гены зеленого и красного пигментов содержат 6 экзонов и 5 нитронов и кодируют белки, состоящие из 364 аминокислотных остатков и различающиеся между собой только 14 остатками. Сравнение последовательностей зеленого и красного пигментов с родопсином приводит к заключению, что удлинение их цепи произошло вследствие появления – по сравнению с родопсином – N-концевого фрагмента из 16 аминокислот. 40% последовательности этих белков идентично родопсину, 43% - синему пигменту.

Проведенный в работе теоретический анализ вторичной структуры зрительных пигментов человека показывает, что наиболее вероятный способ укладки полипептидных цепей белков в мембране – это структура типа "семь столбов", как и в случае родопсина быка. В этой же работе проведено сравнение структуры зрительных пигментов человека и быка, направленное на выявление консервативных и вариабельных участков их полипептидных цепей. Авторы исходили из того, что наибольшей консервативностью должны обладать те участки полипептидных цепей, которые несут наиболее важную функциональную нагрузку. Оказалось, что самыми консервативными являются 7-й трансмембранный сегмент и петля между 4-м и 5-м трансмембранными сегментами. Высокая степень гомологии этих участков выявляется даже при сравнении последовательностей родопсина млекопитающих и насекомых. В положении, соответствующем 296 остатку молекулы родопсина быка, все исследованные пигменты содержат остаток лизина, который, по-видимому, служит местом связывания 11-цис-ретиналя. Еще два ионизируемых аминокислотных остатка присутствуют во всех известных зрительных пигментах позвоночных в 3 трансмембранном сегменте вблизи от цитоплазматической поверхности фоторецепторной мембраны – это остатки глутамата и аргинина в положениях, соответствующих 134 и 135 остаткам молекулы родопсина быка; им гомологична пара аспартат¹⁴⁷ – аргинин¹⁴⁸ в родопсине дрозофилы. Наиболее вариабельны N- и С-концевые последовательности, хотя у всех исследованных пигментов на N-конце присутствуют потенциальные участки гликозилирования, а на С-конце - участки фосфорилирования.

Обсуждая вопрос о том, какие особенности строения зрительных пигментов человека обеспечивают различную степень батохpoмного сдвига в их спектре поглощения, Nathans и соавт. указывают на различия в величине суммарного внутримембранного заряда в молекулах этих белков. Так, внугримембранный заряд наиболее коротковолнового синего пигмента составляет +1, заряд родопсина из палочек равен 0, а у наиболее длинноволновых зеленого и красного пигмента – -1. Авторы полагают, что эти различия могут служить, по крайней мере, одной из причин, обусловливающих различие в положении максимумов поглощения различных пигментов.

В настоящее время накоплена информация о последовательности аминокислот в молекулах 11 различных зрительных пиментов, которая легла в основу гипотезы об их эволюции. Предполагается, что зрительные пигменты позвоночных и беспозвоночных произошли от одного предшественника около 1 миллиарда лет тому назад. Спустя примерно 500 миллионов лет родопсин позвоночных дал начало пигменту палочек, а также колбочковым синему и длинноволновому пигментам. Со времени же дивергенции длинноволнового пигмента в зеленый и красный прошло всего 30-40 миллионов лег.

Еще одним, весьма перспективным направлением применения методов молекулярной генетики для изучения связи между структурой и функциями родопсина является использование направленных аминокислотных замен в молекуле родопсина. В настоящее время уже синтезирован ген родопсина быка, имеющий 28 участков рестрикции, что позволяет проводить направленные замены любых нуклеотидов, а, следовательно, и любых аминокислотных остатков в полипептидной цепи кодируемого этим геном родопсина.

Таким образом, при исследовании зрительных пигментов методами молекулярной генетики используются два основных подхода. Первый из них связан с анализом, в том числе и со сравнительно-эволюционным, первичной структуры пигментов из разнообразных объектов, второй – с применением направленных мутаций для установления связи между структурой и функциями зрительных пигментов.

4.3. Взаимодействие родопсина с другими белками

Основная функция родопсина как "фермента" заключается в его способности взаимодействовать с несколькими белками из наружных сегментов фоторецепторных клеток, к числу которых относятся трансдуцин, родопсинкиназа и белок с молекулярной массой 48 кД. Связывание родопсина с трансдуцином приводит к GDP/GTP ообмену на трансдуцине и последующей диссоциации образующегося комплекса, связывание с родопсинкиназой – к фосфорилированию родопсина; белок способен, скорее всего, взаимодействовать только с фосфорилированным родопсином, образуя с ним прочный комплекс. О функциональной роли каждого из трех будет подробно сказано в последующих разделах, а сейчас рассмотрим, как происходит их взаимодействие с родопсином. Существенно, что в описанных взаимодействиях принимает участие исключительно фотовозбужденный родопсин: ни родопсин, ни опсин такой способностью не обладают.

Рассмотрим сначала, в какой последовательности проходит взаимодействие перечисленных белков с родопсином в фоторецепторной клетке, учитывая, что в каждый момент времени родопсин может находиться в комплексе лишь с одним из трех белков.

Конкуренция между трансдуцином и родопсинкиназой за связывание с фотовозбужденным родопсином изучена в работе, где показано, что в условиях избытка этих ферментов по отношению к обесцвеченному родопсину, то есть в физиологических условиях работы фоторецепторных клеток, с родопсином связывается преимущественно трансдуцин. Связывание родопсинкиназы и фосфорилирование родопсина происходит лишь после GTP— зависимой диссоциации комплекса родопсин-трансдуцин.

В результате фосфорилирования родопсин приобретает высокое сродство к 48 кД – белку, не теряя при этом способности связывать трансдуцин. В работе обнаружена конкуренция между трансдуцином и 48 кД белком за связывание с фосфорилированным фотовозбужденным родопсином и показано, что сродство этих белков к родопсину примерно одинаково. Здесь, как и в случае родопсинкиназы, добавление в реакционную смесь GTP приводит к диссоциации трансдуцина из комплекса с родопсином и преимущественному связыванию 48 кД-белка.

Таким образом, можно предложить следующую схему последовательности взаимодействия родопсина с белками НСП: обесцвечивание родопсина приводит, в первую очередь, к активации трансдуцина; через некоторое время родопсин фосфорилируется, продолжая активировать трансдуцин, хотя и медленнее, чем нефосфорилированный; последующее связывание 48 кД-белка приводит к полному прекращению взаимодействия родопсина с другими белками.

Перейдем теперь к анализу молекулярных механизмов взаимодействия родопсина с трансдуцином и 48 кД-белком (взаимодействие с родопсинкинаэой будет рассмотрено в подразделе 4.4., посвященном фосфорилированию родопсина).

4.3.1. Взаимодействие родопсина с трансдуцином

Из всех интермедиатов фотолиза родопсина способностью связывать трансдуцин обладает только метародопсин II. Этот вывод впервые сделан в работе, где была проведена прямая корреляция между концентрацией метародопсина II и количеством связанного с родопсином трансдуцина через различное время после освещения реакционной смеси вспышкою света. Позднее этот результат подтвердили при изучении свойств родопсина, у которого протон шиффова основания был заменен на метильную группу. При обесцвечивании такого родопсина происходит образование интермедиата, сходного с метародопсином I, который затем медленно распадается на опсин и полностью-транс-ретиналь, минуя образование интермедиатов типа метародопсина II. Так как модифицированный родопсин не обладал способностью взаимодействовать с трансдуцином, был сделан вывод о необходимости образования метародопсина II для приобретения родопсином этой способности.

Связывание трансдуцина с родопсином приводит к "замораживанию" фотолиза на мета-П-стадии, происходящему как вследствие сдвига равновесия метародопсин I « метародопсин II в сторону метародопсина II, так и по причине замедления перехода метародопсина II в метародопсин III.

Гораздо меньше известно о том, какие участки молекулы родопсина непосредственно участвуют в образовании комплекса с трансдуцином. Для ответа на этот вопрос в работе выяснялось, как протеолиз родопсина термолизином сказывается на его способности взаимодействовать с трансдуцином. В этой работе использовались два типа препаратов родопсина: первый из них был получен протеолизом родопсина в составе фоторецепторных мембран в течение 5 минут с отщеплением 12 аминокислотных остатков от С-концевого фрагмента молекулы; второй получали путем 13-часового протеолиза, в результате которого происходило дополнительное расщепление полипептидной цепи родопсина между 5-м и 6-м α-спиральными сегментами, причем образующиеся фрагменты молекулы оставались связанными между собой за счет гидрофобных взаимодействий. Оказалось, что кратковременный протеолиз сказывается на способности родопсина связывать и активировать трансдуцин, в то время как длительный протеолиз приводит к практически полному подавлению взаимодействия этих белков. Отсюда было сделано два вывода: 1) двенадцать С-концевых аминокислотных остатка не участвуют во взаимодействии с трансдуцином и 2) функциональные группы, принимающие участие во взаимодействии с трансдуцином, локализованы между 5-м и 6-м трансмембранными сегментами в молекуле родопсина. Первый из выводов подтвержден также в работах, где показано, что отщепление до 19 аминокислотных остатков от С-концевого участка молекулы родопсина не приводит к ингибированию светозависимой фосфодиэстеразной реакции в суспензии фоторецепторных мембран. Второй же из этих выводов представляется малообоснованным, поскольку расщепление молекулы родопсина на два нековалентно связанных фрагмента является воздействием, которое может сказываться на конформации участков полипептидной цепи белка, пространственно удаленных от места расщепления.

Рис.11. Расположение в полипептидной цепи родопсина фрагментов, структура которых соответствует полипептидам Rhod 1, Rhod 2 и Rhod 3, использованным в работах.

Другой подход к поиску центров связывания трансдуцина на родопсине использовался в работах, где были синтезированы девять пептидов со структурой, соответствующей участкам полипептидной цепи родопсина, которые экспонированы в цитоплазму НСП. Исследование влияния преинкубации трандуцина с этими пептидами на его последующее взаимодействие с фотовозбужденным родопсином показало, что три пептида (Rhod I, Rhod 2 и Rhod 3), которые перекрывают аминокислотную последовательность родопсина между 317-м и 339-м остатками (рис. 11), способны эффективно подавлять активацию трансдуцина. Отсюда был сделан вывод, что структура этих пептидов соответствует структуре трансдуцинсвязывающего центра на родопсине, что и обусловливает их ингибирующее действие.

Способность указанных пептидов конкурировать с родопсином за связывание с трансдуцином весьма чувствительна к замене входящих в их состав аминокислотных остатков. Так, замена двух треонинов на изолейцин в пептидах Rhod 1 и Rhod 3, двух серинов на валин в Rhod 1 и двух аспартатов на аланин в Rhod 2 приводит к утрате этими пептидами ингибирующего действия.

Имеются также предварительные данные о том, что пептиды, структура которых соответствует участку между 5-м и 6-м трансмембранными сегментами молекулы родопсина, так же обладают способностью конкурировать с родопсином за связывание с трансдуцином.

Отсюда можно сделать заключение, что молекула родопсина имеет два участка, принимающих участие во взаимодействии с трансдуцином: один из них находится между 230-м и 250-м, а другой - между 317-м и 339-м аминокислотными остатками.

4.3.2. Взаимодействие родопсина с 48 кД-белком

Из трех белков НСП, обладающих способностью светозависимо связываться с родопсином, наименее изучен цитоплазматический белок с молекулярной массой 48 кД. Количество 48 кД-белка в цитоплазме фоторецепторных клеток весьма значительно и сопоставимо с количеством трансдуцина. Интересно, что этот белок идентичен так называемому "S-антигену", вызывающему аутоиммунное поражение глаза.

Функция 48 кД-белка в фоторецепторной клетке окончательно не установлена. В литературе высказывались две точки зрения по этому вопросу. Согласно первой из них, 48 кД-белок образует прочный комплекс с фосфорилированным родопсином, что приводит к прекращению активации трансдуцина. Согласно второй , - 48 кД-белок светозависимо обменивает ADP на АТР, подобно тому, как это делает трансдуцин, обменивая GDP на GTP, после чего модулирует активность фосфодиэстеразы cGMP; необходимость фосфорилирования родопсина для активации 48 кД-белка в рамках этой гипотезы не подразумевается.

Вне зависимости от того, какая из предложенных точек зрения верна, можно считать твердо установленным, что прочный комплекс с 48 кД-белком способен давать только обесцвеченный фосфорилированный родопсин. Этот комплекс не диссоциирует в присутствии адениловых и гуаниловых нуклеотидов, а также после многократного промывания фоторецепторных мембран гипотоническим буфером. Нельзя исключить, однако, что 48 кД-белок все же способен взаимодействовать с нефосфорилированным родопсином, хотя и без образования прочного комплекса. Информация о том, какие интермедиаты фотолиза родопсина способны связывать этот белок, какие аминокислотные остатки в молекуле родопсина принимают участие в этом взаимодействии и каков механизм диссоциации образующегося комплекса, в настоящее время отсутствует.

4.4. Фосфорилирование родопсина

Фосфорилирование родопсина было обнаружено независимо тремя группами исследователей: Kuhn и Dreyer и Frank и соавт. на суспензии НСП быка, а также Bownds и соавт. на НСП лягушки. Позднее было показано, что эта реакция может происходить также у головоногих моллюсков и насекомых.

4.4.1. Выделение и свойства родопсинкиназы

Реакцию фосфорилирования родопсина катализирует родопсинкиназа, содержание которой в НСП составляет примерно 1 моль на 400 молей родопсина. Первоначально предполагалось, что родопсинкиназа - мембранный белок, однако оказалось, что в темноте этот фермент не связан с фоторецепторными мембранами, поскольку для его экстракции в НСП достаточно лишь разрушения сегментов. На свету родопсинкиназа образует прочный комплекс с фотовозбужденным родопсином, и из мембран экстрагируется не более 10% ее активности.

Метод выделения родопсинкиназы описан в работе, где фермент экстрагировали из НСП быка при помощи 1 М NН₄Сl, фракционировали экстракт сульфатом аммония, а затем проводили гель-фильтрацию на сефакриле S-200 и две последовательные хроматографии на голубой сефарозе CL-6В. В результате очистки был получен гомогенный фермент с молекулярной массой 50 кД по данным электрофореза в присутсвии ДСН и 53 кД - по данным гель-фильтрации на сефакриле S-200. Предложенный метод очистки трудно признать удачным, поскольку потери активности фермента при выделении составляли 98%.

Еще один метод, позволяющий достичь 16%-ной чистоты препарата родопсинкиназы практически без потерь ее активности, предложен в работе. Здесь сначала проводилось связывание родопсинкиназы с обесцвеченными фоторецепгорными мембранами путем инкубации НСП на свету, а затем, после тщательной отмывки мембран от несвязанных белков, - элюция фермента в присутствии 350 мМ KCl. Наличие родопсинкиназной активности в этом препарате коррелировало с присутствием белка с молекулярной массой 69 кД. Остальной белок был в основном представлен двумя компонентами: β-субъединицей трансдуцина и полипептидом неизвестной функции с молекулярной массой 56 кД. Попытки провести дальнейшую очистку фермента различными хроматографическими методами не увенчались успехом.

Указание на то, что молекулярная масса родопсинкиназы составляет 68-69 кД, получено также и в других работах, где ее определяли при гель фильтрации белков НСП. Кроме того, наличие родопсинкиназной активности в экстрактах НСП, полученных разными способами, коррелировало с присутствием полосы 68 кД на электрофореграммах, и именно этот белок прочно связывался с фоторецепторными мембранами на свету.

Существуют три объяснения расхождений в оценке молекулярной массы родопсинкиназы. Согласно первому из них, препарат, полученный в работе , был негомогенен и содержал в основном примесный белок с молекулярной массой около 50 кД неизвестной функции. Вторая возможность заключается в том, что этот препарат представлял собой продукт протеолиза родопсинкиназы под действием эндогенных протеиназ. Наконец, третье объяснение предполагает, что в фоторецепторных клетках присутствуют две формы родспсинкиназы - одна с молекулярной массой 50 кД, а другая - 68 кД, причем первая не является продуктом протеолиза второй.

Несмотря на отсутствие надежного метода очистки родопсинкиназы, основные параметры реакции, катализируемой этим ферментом, исследованы достаточно подробно. Основное свойство реакции фосфорилирования родопсина заключается d ее строгой светозависимости, причем свет вызывает не активацию фермента, а как бы активирует субстрат - родопсин, индуцируя конформационные изменения в его молекуле.

Выяснению вопроса о том, на какой стадии фотолиза родопсин становится субстратом для фосфорилирования родопсинкиназы, посвящены работы. В первой из них проводилось обесцвечивание родопсина в НСП лягушки, таким образом, чтобы остановить фотолиз на определенных стадиях. После этого сегменты охлаждались до -196°С, и присутствующий в них родопсин подвергался фоторегенерации светом соответствуюшей длины волны. После этого пробы нагревались в темноте до 25°С и к ним добавлялся АТР. Оказалось, что родопсин, регенерированный из мета I- и мета II- форм, в этих условиях фосфорилируется, а регенерированный из бато-люми-форм - нет. Отсюда было сделано два вывода: во-первых, изменение конформации молекулы родопсина, обеспечивающее "запуск" фосфорилирования, происходит при переходе люмиродопсин - метародопсин I; во-вторых, конформация фосфорилируемого участка молекулы родопсина при фоторегенерации не восстанавливается до исходной темновой. Очевидно, что эти выводы можно было бы считать однозначными лишь в том случае, если бы описанная выше фоторегенерация родопсина из мета-форм проходила полностью. Однако из приведенных в работе данных следует, что выход фоторегенерации в мета I- и мета II- конформации составлял примерно 60%, а уровень фосфорилирования в полученном препарате был немногим более половины по сравнению с контрольными, полностью обесцвеченными мембранами. Так что описанные результаты могут быть объяснены и фосфорилированием того родопсина, который не был регенерирован на стадии мета I, затем после нагревания суспензии перешел в метародопсин II.

Более обоснованной выглядит точка зрения, высказанная в работе, где утверждается, что фосфорилирование родопсина начинается после перехода метародопсин I → метародопсин II. Здесь изучалось фосфорилирование родопсина при -10°С в условиях стабильного мета I « мета II равновесия и отсутствия распада метародопсина II в метародопсин I или опсин. Оказалось, что в этом случае фосфорилирование родопсина проходит наиболее эффективно при подкислении среды до рН 6.0, когда равновесие мета I « мета II значительно сдвинуто в сторону образования метародопсина II. Если учесть, что рН-оптимум для активности родопсинкиназы составляет 7,4, вывод, сделанный в этой работе, представляется достаточно аргументированным. Одновременное измерение фосфорилирования родопсина и спектральных переходов в суспензии НСП, проведенное в работе, показало, что метародопсин III также может служить субстратом для родопсинкиназы. Конечный продукт фотолиза - опсин - утрачивает способность фосфорилироваться, при этом его свойство восстанавливаться ретиналем не зависит от того, был он предварительно фосфорилирован или нет.

Неожиданный результат, на первый взгляд, находящийся в противоречии с представлениями об отсутствии активации самой родопсинкиназы на свету, получен в работе. В этой работе изучалось фосфорилирование родопсина (исходно содержащего 11-цис-региналь) в суспензии НСП при слабых вспышках света; по окончании реакции обесцвеченный родопсин регенерировали 11-цис-ретиналем. В результате примерно половина фосфорилированного родопсина содержала в качестве хромофора 9-цис-региналь, а другая половина - 11-цис-рети-наль. Таким образом, в описанных экспериментах происходило фосфорилирование не только фотовозбужденного, но и необесцвеченного родопсина. Контрольные опыты показали, что наблюдаемый эффект нельзя объяснить 9-цис → 11-цис изомеризацией ретиналя или регенерацией обесцвеченного фосфорилированного родопсина примесью 11-цис-ретиналя, присутствующего в НСП, а также обменом хромофорами между отдельными молекулами пигмента.

Каким образом происходило фосфорилирование темнового родопсина в этих опытах неясно. Автор предлагает два возможных объяснения, которые не противоречат общепринятой точке зрения о том, что фосфорилирование родопсина обусловлено не активацией родопсинкиназы, а "активацией" ее субстрата. Первое из них сводится к тому, что фосфорилированный и нефосфорилированный родопсин обмениваются остатками фосфата; второе - к тому, что фотовозбужденный родопсин способен индуцировать конформационные перестройки в соседних "темновых" молекулах родопсина, приводящие к их фосфорилированию.

Родопсинкиназа обладает высокой специфичностью к фотовозбужденному родопсину как субстрату: она практически не фосфорилирует фосвитин, казеин, протамин и гистоны.

Изучение зависимости фосфорилирования родопсина от нуклеотидов показало, что субстратом фосфорилирования может служить комплекс Mg²⁺ с АТР или GTP, а также комплекс Mn²⁺ с GTP, при этом величина К_m для АТР составляет 8-20 мкМ, для GTP - 120-400 мкМ.

Максимальная скорость родопсинкиказной реакции зависит от состава среды: V_max для GTP-зависимого фосфорилирования в трис-буфере выше, чем для АТР зависимого фосфорилирования; в фосфатном буфере наблюдается обратное соотношение. AMP и аденозин в концентрации свыше 0,1 мкМ являются слабыми ингибиторами реакции.

В большинстве работ по фосфорилированию родопсина не выявлено зависимости этого процесса от циклических нуклеотиндов. Однако в двух более поздних исследованиях обнаружено ингибирование фосфорилирования под действием cGMP. Особый интерес представляет работа, где показано, что cGMP в концентрации 0,1 мМ вызывает семикратное ингибирование фосфорилирования родопсина в НСП, а добавление в реакционную смесь такого же количества сАМР приводит к ингибированию реакции всего в полтора раза. Важно подчеркнуть, что эта работа была выполнена на НСП, плазматическая мембрана которых оставалась полностью замкнутой после их выделения. Можно предположить, что для проявления эффекта cGMP необходима целостность НСП, так как только в таких препаратах сохраняются дополнительные факторы, легко отмывающиеся во время стандартной процедуры выделения НСП, которая дает препараты с нарушенной плазматической мембраной.

Укажем также на такое свойство родопсинкиназы, как ее способность к аутофосфорилированию. Этот процесс протекает в НСП независимо от света и циклических нуклеотидов.Как отражается фосфорилирование родопсинкиназы на ее функциях, в настоящее время неизвестно.

4.4.2. Характеристика фосфорилированного родопсина

Фосфорилированию в родопсине подвержены остатки серина и треонина, входящие в состав С-концевого фрагмента его полипепгидной цепи.

При определении количества включенного в родопсин фосфата в большинстве исследований получено значение 1-2 моля фосфата на моль родопсина (обозначим эту величину P/R). В работе удалось повысить включение фосфата в родопсин до 7 P/R, и, как утверждают авторы, этот результат был достигнут благодаря подбору оптимальных концентраций АТР и Mg²⁺ (3 и 1 мМ соответственно) и условий освещения суспензии. Однако в более ранней работе, выполненной в той же лаборатории, включение фосфата практически в тех же условиях составляло всего лишь 1-2 P/R. Так что понять, какие же именно особенности постановки эксперимента или выделения НСП в работе позволили столь значительно увеличить P/R, неясно.

Повышение эффективности фосфорилирования может быть достигнуто при обесцвечивании небольшой доли (менее 1%) родопсина в НСП. Здесь определяемое включение фосфата в белок доходило до 20-40 P/R, что превосходит количество остатков серина и треонина в молекуле родопсина, экспонированных на поверхность фоторецепторной мембран. Полученный результат можно объяснить, скорее всего, тем, что на слабом свету, наряду с фосфорилированием фотовозбужденного родопсина, происходит также фосфорилирование темнового родопсина, обнаруженное в работе.

Препарат фосфорилированного родопсина представляет собой смесь его индивидуальных форм сразличной величиной P/R. Эти формы можно отделить друг от друга, предварительно переведя родопсин в раствор с помощью детергента. В работе проведено разделение индивидуальных фосфорилированных форм родопсина с помощью аналитического изоэлектрофокусирования. Метод основан на том, что присоединение каждого последующего остатка фосфата к молекуле родопсина смещает изоэлектрическую точку белка в кислую область. Фосфорилированный препарат родопсина с исходной средней величиной P/R, равной двум, содержит около 40% нефосфорилированного белка и 4 индивидуальные фосфорилированные формы с величинами P/R 2, 4 и 5, а также форму, содержание фосфата в которой было определено с низкой точностью и составляло, по-видимому, 7 P/R.

Разработаны также методы препаративного разделения молекул родопсина, содержащих различное число остатков фосфата. В работе для анализа препарата родопсина с величиной P/R 0,8 была использована ионообменная хроматография на ECTEOLA-целлюлозе. При этом 84% родопсина оказались нефосфорилированными, а оставшиеся 16% смодержали 5 молей фосфата на моль белка; другие фосфорилированные формы в препарате отсутствовали.

Для интерпретации столь неожиданного результата было высказано предположение о том, что в описанных экспериментах фосфорилировался преимущественно родопсин, находящийся в недавно сформированных дисках. Для проверки этой гипотезы лягушкам давали [³H] лейцин за 4 дня до постановки эксперимента. После фосфорилирования препаратов НСП, полученных из этих лягушек, оказалось, что удельная тритиевая радиоактивность фосфорилированного родпосина в несколько раз выше, чем у нефосфорилированного, что свидетельствует в пользу преимущественного включения фосфата во вновь синтезированный родопсин.

Проверка гипотезы о преимущественном фосфорилировании родопсина в составе недавно сформировавшихся дисков была проведена в работах с использованием метода микрорадиоавтографии. Здесь, в отличие от предыдущей работы, фосфатная метка включалась в родопсин диффузно по всей длине НСП. При освещении НСП пятном света с диаметром меньшим, чем размер сегмента, включение фосфата наблюдалось только в обесцвеченной зоне, причем интенсивность фосфорилирования в середине и на концах сегмента была одинакова.

Более вероятная интерпретация результатов работы состоит в том, что АТР здесь просто не успевал продиффундировать от места повреждения плазматической мембраны по всей длине НСП. В пользу такой интерпретации говорит тот факт, что плазматическая мембрана чаще всего оказывается незамкнутой у основания сегмента, то есть именно там, где происходит формирование новых фоторецепторных дисков.

Хроматография на каскаде из микроколонок с ECTEOLA-целлюлозой использовалась в работе для анализа препарата родопсина со средней величиной P/R, равной 7. Оказалось, что большая часть молекул родопсина содержит 6-9 фосфатных остатков, а остальные - от 0 до 7. Авторы полагают, что P/R = 9 - предельно возможное включение фосфата в родопсин. Эта величина совпадает с количеством остатков серина и треонина, входящих в состав С-концевого участка родопсиновой молекулы.

Основным недостатком разделения фосфорилированных форм родопсина на ECTEOLA-целлюлозе следует признать то, что практически ни одну из них не удается выделить в чистом виде. Более удачный подход к решению этой задачи - хроматофокусирование фосфорилированного родопсина в присуствии неионного детергента октилглюкозида. Этот метод позволяет получать практически гомогенные индивидуальные фосфорилированные формы родопсина с величинами P/R, равными 0, 2, 4, 5, 6, 8 и 9; недавно обнаружена также форма 7 P/R. Заметим, что формы 1 и 3 P/R отсутствуют во всех исследованных препаратах вне зависимости от степени фосфорилирования родопсина. Существенно, что разрешающую способность описанного метода можно значительно повысить, если проводить хроматофокусирование при повышенном давлении на колонке monoP, подключенной к системе FPLC (Pharmacia).

4.4.3. Фосфорилирование родопсина протеинкиназой C и киназой β-адренергического рецептора.

На протяжении более 10 лет предполагалось, что родопсинкиназа является единственным ферментом, способным фосфорилировать родопсин. Действительно, добавление к фоторецепторным мембранам протеинкиназ из большого числа различных органов и тканей не приводит к фосфорилированию родопсина. Однако в 1986 г. были опубликованы две работы, сообщавшие, что фосфорилирование родопсина могут катализировать киназа β-адренергического рецептора и протеинкиназа С из НСП.

В первой из них показано, что добавление киназы β-адренергического рецептора к суспензии фоторецепторных мембран приводит к фосфорилированию родопсина, причем наблюдаемая реакция строго светозависима. Родопсинкиназа, в свою очередь, способна фосфорилировать β-адренергический рецептор, если он находится в связанном с агонистом состоянии. Следовательно, между двумя рецепторными белками - родопсином и β-адренергическим рецептором – существует структурное и функциональное сходство.

Во второй из указанных работ обнаружено фосфорилирование родопсина в присутствии протеинкиназы С. Этот фермент содержится в НСП в количестве примерно в 2000 раз меньшем, чем родопсин. В отличие от родопсинкиназы протеинкиназа С активна и с необесцвеченным родопсином, но требует присутствия в реакционной среде диацилглицерина и ионов Са²⁺ (полунасыщение наблюдается при концентрации Са²⁺ около 1мкМ). Не ясно, однако, происходит ли фосфорилирование родопсина под действием протеинкиназы С in vivo. Во всяком случае, эксперименты, выполненные на живых лягушках, указывают на то, что в темноте практически весь родопсин нефосфорилирован. Еще менее вероятно, что активация протеинкиназы С наблюдается на свету, поскольку в этих условиях концентрация свободного Са²⁺ в цитоплазме НСП падает по сравнению с темноадаптированными клетками.

Анализ структуры родопсина, фосфорилированного в темноте действием протеинкиназы С, показал, что в этом случае фосфорилируются те же аминокислотные остатки, что и в отсутствии родопсинкиназы на свету. Отсюда следует, что участки фосфорилирования в полипептидной цепи родопсина доступны для киназ и в темноте, а на свету происходит депонирование центров связывания родопсинкиназы, локализация которых в настоящее время неизвестна.

4.4.4. Дефосфорилирование родопсина

Фосфорилированный родопсин может подвергаться дефосфорилированию, вероятнее всего, под действием специальной фосфатазы. Дефосфорилирование родопсина проходит в часовой шкале времени как in vitro, так и in vivo, что было продемонстрировано в экспериментах на живых лягушках.

Механизм и регуляция реакции дефосфорилирования родопсина не изучены. К числу надежно установленных фактов можно отнести лишь ингибирование этой реакции фосфатом. Благодаря этому свойству проведение реакции фосфорилирования родопсина в фосфатном буфере позволяет избежать его одновременного дефосфорилирования, что и используется при получении фосфорилированных препаратов родопсина с максимальным включением фосфата.

4.5. Биосинтез опсина

Биосинтез опсина протекает во внутреннем сегменте фоторецепторных клеток на шероховатом эндоплазматическом ретикулуме, локализованном вблизи клеточного ядра. Одновременно происходит и интеграция полипептидной цепи опсина в мембрану эндоплазматического ретикулума. Образующиеся молекулы опсина проходят через аппарат Гольджи, а затем попадают в состав отщепляющихся от него небольших мембранных везикул. Эти везикулы мигрируют к основанию наружного сегмента и сливаются с плазматической мембраной фоторецепторной клетки. В результате этих событий опсин оказывается встроенным в фоторецепторкую мембрану.

Работа посвящена изучению механизма, обеспечивающего встраивание полипептидной цепи опсина в мембрану. В ней показано, что опсин относится к белкам, полипептидная цепь которых имеет в своем составе так называемую сигнальную последовательность, содержащую около 20 аминокислотных остатков и находящуюся, как правило, в N-концевой части молекулы. Освобождаясь из рибосомы в процессе трансляции, сигнальная последовательность связывается с цитоплазматическим нуклеопротеидным комплексом, получившим название распознающей сигнал частицы (SRP). В результате дальнейший синтез белка прекращается до тех пор, пока комплекс рибосомы с SRP не провзаимодействует со специфическим рецептором на микросомальной мембране. После этого синтез белка возобновляется, причем освобождение полипептидной цепи происходит непосредственно в мембранный канал, образованный, по крайней мере частично, микросомальным рецептором и SRP. Прекращение интеграции полипептидной цепи в мембрану обусловлено, по-видимому, наличием специальной терминирующей последовательности, обеспечивающей диссоциацию белка от мембранного канала. После завершения синтеза белка сигнальная последовательность у одних белков отщепляется при помощи специфической протеиназы, а у других, к числу которых относится опсин, остается в составе молекулы на протяжении всего времени жизни белка.

В работе изучалась трансляция опсиновой мРНК в реконструированной бесклеточной системе в присутствии микросомальных мембран и SRP. Опсиновая мРНК, в свою очередь, была получена в результате транскрипции плазмиды, содержащей ген бычьего опсина. Вывод о наличии в молекуле родопсина сигнальной последовательности был сделан на основании двух основных фактов: 1) синтез опсина прекращался, если в реконструированной системе присутствовали SRP, но отсутствовали микросомальные мембраны; 2) трансмембранный перенос N-концевой последовательности внутрь микросом происходил при наличии SRP в смеси (о трансмембранном переносе авторы судили по гликозилированшо N-концевой последовательности опсина, происходящему только внутри микросом).

Далее для выяснения локализации сигнальной последовательности в полипептидной цепи опсина был получен набор делеционных производных гена опсина, после чего выяснялось, содержится ли сигнальная последовательность в соответствующих фрагментах опсиновой молекулы. Первый из исследованных фрагментов состоял из N-концевой последовательности (примерно из 30-и аминокислотных остатков), 7-го α-спирального сегмента и С-концевой последовательности; сигнальная последовательность в нем отсутствовала (о ее наличии судили по тем же тестам, что и в случае нормального опсина). В то же время фрагмент из 93-х N-концевых аминокислотных остатков содержал в своем составе сигнальную последовательость. Учитывая результат предыдущего эксперимента об отсутствии сигнальной последовательности среди 30-и N-концевых остатков, а также то обстоятельство, что в процессе биосинтеза белка 30-40 С-концевых остатков находятся внутри рибосомы, а освобождающиеся из рибосомы полипептиды с SRP не взаимодействуют, был сделан вывод о том, что обнаруженная сигнальная последовательность локализована между 30-м и 60-м остатками, то есть в первом α-спиральном сегменте.

Так как помимо N-концевой последовательности еще три участка полипептидной цепи опсина экспонированы во внутридисковое пространство, авторы этой работы предприняли попытку выяснить, происходит ли трансмембранный перенос указанных участков при участии дополнительных сигнальных последовательностей или интеграция оставшейся части молекулы опсина в мембрану проходит самопроизвольно, например, подобно тому, как происходит встраивание в мембрану цитохрома b₅. Поиск дополнительных сигнальных последовательностей в молекуле родопсина показал, что такая последовательность действительно содержится во фрагменте, состоящем из N-концевого участка, 6 и 7-го α-спиральных сегментов и С-концевого участка. Поскольку из результатов предыдущих экспериментов вытекало, что N- и С -концевые участки и 7-ой α-спиральный сегмент сигнальных последовательностей не содержат, был сделан вывод о том, что вторая обнаруженная ими сигнальная последовательность локализована в 6-м трансмембранном сегменте.

Следуя аналогичной логике, можно было бы проверить, присутствуют ли сигнальные последовательности в остальных трансмембранных сегментах, однако авторы ограничились тем, что высказали гипотезу о наличии в полипептидной цепи родопсина четырех сигнальных последовательностей, локализованных в начале 1, 2, 4 и 6-го сегментов, и четырех терминирующих последовательностях в конце 1, 3, 5 и 7-го сегментов.

Несмотря на свою незавершенность, рассмотренная работа представляет огромный интерес не только потому, что объясняет, каким образом происходит интеграция опсина в липидный бислой, но и потому, что в ней на примере опсина впервые показано наличие нескольких сигнальных последовательностей в молекуле одного мембранного белка.

На этом мы завершаем рассмотрение структуры и функциональных свойств интегрального белка фоторецепторных мембран родопсина и переходим к описанию второго участника фосфодиэстеразного каскада фоторецепторной клетки - GTP-связывающего белка трансдуцина.

5. ТРАНСДУЦИН

Каскад ферментативных реакций, приводящих к гидролизу GМР в освещенных НСП, включает два основных этапа: на первом фотовозбужденный родопсин катализирует переход сотен молекул и GTP-связывающего белка трансдуцина из неактивного стояния в активное, на втором - активированный трансдуцин, в свою очередь, стимулирует активность ФДЭ.

Трансдуцин, выполняющий роль среднего звена фосфодиэтеразного каскада, непосредственно воспринимает сигнал фотовозбужденного родопсина, усиливает его (при взаимодействии с одной молекулой родопсина образуется несколько сотен молекул активированного трансдуцина) и передает эффективному ферменту ФДЭ, которая дополнительно усиливает сигнал, интенсивно гидролизуя cGMP.

Термин "трансдуцин" для обозначения полифункционального белка, участвующего в передаче сигнала от фотовозбужденного родопсина к ФДЭ в НСП, предложен в 1981 г. Fung и соавт., в ряде других работ используются также названия "G-белок" и "светоактивируемая ГТФаза".

Полифункциональность трансдуцина определяется его ролью в цепи передачи информации от родопсина к плазматической мембране: он должен выделять сигнал (фотовозбужденный родопсин) на фоне невозбужденных молекул, поэтому он обладает высоким сродством к одному из интермедиатов обесцвеченного родопсина и крайне низким сродством - к темновому родопсину; переход трансдуцина из неактивного состояния в активное должен быть быстрым, обеспечивать усиление сигнала и быть обратимым, для того, чтобы клетка могла среагировать на следующий сигнал - это достигается путем обмена связанного с белком GDP на GTP, после которого активированный трансдуцин теряет сродство к фотовозбужденному родопсину, диссоциирует от него, освобождая место для следующих молекул трандуцина, а затем вновь переходит в неактивное состояние, гидролизуя связанный с ним GTP до GDP; наконец GTP-содержащий трандуцин выполняет роль белка-регулятора ФДЭ, непосредственно гидролизуюшей cGMP.

Детальное рассмотрение свойств грансдуцина начнем с анализа его структуры.

5.1. Структура трансдуцина

В состав трансдуцина входят три полипептида: α, β θ γ (θли соответственно Т_α, Т_β и Т_γ), отличающиеся по молекулярной массе. Их подвижность при электрофорезе в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях соответствует молекулярным массам 37-41кД, 35-37 кД и 6-10 кД. Изоэлектрические точки субъединиц равны 5,3; 5,9 и 5,2 соответственно.

Определена последовательность аминокислот во всех трех субъединицах. Первой путем прямого секвенирования белка была установлена первичная структура γ-субъединицы (рис. 12). Полипептидная цепь Т_γ состоит из 69 аминокислотных остатков, ее молекулярная масса составляет 8008,7. Аналогичная последовательность Т_γ получена при анализе кДНК, однако в этом случае в области, кодирующей С-концевой участок полипептида, обнаруживается нуклеотидная последовательность, соответствующая олигопептиду Cys-Val-Ile-Ser, который, по-видимому, отщепляется в результате посттрансляционной модификации. Интересной особенностью первичной структуры Т_γ служит наличие дисульфидной связи между двумя соседними остатками Cys³⁵ - Cys³⁶.

Рис. 12. Полная аминокислотная последовательность γ-субъединицы трансдуцина. Отмечено положение дисульфидной связи между соседними остатками цистеина

Аминокислотная последовательность β-субъединицы определена путем клонирования и секвенирования фрагментов ДНК, комплементарных мРНК Т_β. Полипептид, кодируемый кДНК, включает 340 аминокислотных остатков (в том числе инициирующий N-концевой остаток Met), что соответствует молекулярной массе полипептида 37 375 (рис. 13). В клетке синтезированный полипептид претерпевает посттрансляционную модификацию - отщепление N-концевого Met и ацетилирование концевой аминогруппы.

Рис. 13. Последовательность аминокислот, кодируемая кДНК β-субъединицы трансдуцина

В состав полипептида Т_α, кодируемого кДНК, входит 350 аминокислотных остатков, что соответствует молекулярной массе 39 964 (рис. 14), N-конец синтезированного в клетке полипептида, как и в случае с β-субъединицей ацетилирован.

Рис. 14. Последовательность аминокислот, кодируемая кДНК α-субъединицы трансдуцина. Отмечены аминокислотные остатки, подвергающиеся ADP -рибозилированию в присутствии холерного (*) и коклюшного (**) токсинов.

Именно в α-субъединице локализован нуклеотид-связывающий центр, способный при взаимодействии трансдуцина с родопсином обменивать связанный GDP на GTP и играющий ключевую роль в активации трансдуцина. По данным фотоаффинного связывания аналогов GTP, возможно существование дополнительных центров связывания на β-субъединице, однако их функциональная роль неясна. Во всяком случае, прочно связанный негидролизуемый аналог GTP, гуанилилимидодифосфат (ГИДФ), присоединяющийся к трансдуцину в результате светозависимого нуклеотидного обмена, обнаруживается только в составе α-субъединицы.

Сопоставление аминокислотных последовательностей различных GTP связывающих белков: а-субъединиц белков Ni, Ns и No, p21ras, бактериального фактора элонгации EF-Tu, с аминокислотной последовательностью Тα выявило ряд гомологичных участков, наиболее консервативные из них, как полагают, образуют нуклеотид-связываюшие домены в каждом из белков. При этом, в случае с трансдуцином предполагается, что в формировании GDP/GTP связывающего домена его α-субъединицы участвует фрагмент, расположенный между Lys³¹ и His⁵³, а также участок между Ile180 и Phe270. Предложена пространственная модель нуклеотид-связывающего центра Тα по аналогии с известной третичной структурой GTP -связывающего центра фактора EF—Tu и с учетом гомологии соответствующих участков первичной структуры. Эта модель, в частности, предполагает, что в связывании фосфорильных групп GTP участвует остаток Lys⁴⁷, поскольку соответствующий ему остаток Lys²⁴ в нуклеотид-связываюшем центре EF —Tu расположен непосредственно вблизи фосфорильной группы СТР. Однако вопрос о пространственной структуре нуклеотид-связываюшего центра может быть надежно решен только после того, как будут получены данные рентгеноструктурного анализа Т_α.

Рис. 15. Схема взаимодействия между субъединицами трансдуцина в процессе его активации.

Особого внимания заслуживает вопрос о четвертичной структуре трансдуцина. Говоря о том, что трансдуцин состоит из трех полипептидов, следует отдавать себе отчет в том, что в действительности единый комплекс этих полипептидов реально существует, по-видимому, не на всех этапах активации трансдуцина (рис. 15).

Не совсем ясно, какова четвертичная структура трансдуцина в темноадаптированном состоянии НСП. Многие рассматривают неактивированный трандуцин в качестве гетеротримера Т_αβγ. Оценка размеров молекулы белка методом нейтронного рассеяния дает величину, соответствующую молекулярной массе неактивного трансдуцина 75 кД, данные седиментационного анализа - 80-90 кД, что согласуется с суммарной молекулярной массой всех трех полипептидов. Вместе с тем, ряд фактов не вполне укладывается в рамки такого представления о четвертичной структуре неактивного трансдуцина. Показано, что трансдуцин,

экстрагированный из темноадаптированных НСП в присутствии 1мМ ЭДТА и очищенный с помощью ионообменной хроматографии при центрифугировании в градиенте концентрации сахарозы седиментирует как белок с молекулярной массой 80-90 кД и имеет соответствующую подвижность при электрофорезе в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях при pH 9,5. Однако в этих же условиях обнаруживаются и агрегаты субъединиц типа (Т_α)₂ и (Т_βγ)₂ с молекулярной массой 75-90 кД. Кроме того, в присутствии ионов Mg²⁺ в концентрации, близкой к физиологической (10 мМ), наблюдается диссоциация гетеротримера Т_αβγ на Т_α-GDP и Т_βγ, которые по данным нейтронного рассеяния существуют в виде мономеров Т_α и Т_βγ, а не в виде их агрегатов, как в безмагниевой среде. И при гель-фильтрации присутствии Mg²⁺ очищенный GDP - содержащий трансдуцин ведет себя как белок с молекулярной массой около 40 кД, а не 80-90 кД, то есть также находится преимущественно в диссоциированном виде.

Тем не менее, при физиологических условиях трансдуцин, по-видимому, все-таки представлен преимущественно комплексом Т_αβγ. Во-первых, в препаратах трансдуцина с концентрацией белка свыше 4 мкМ имеет место лишь частичная диссоциация тримера на субъединицы в присутствии 10-100 мМ Mg²⁺, а реальная концентрация трансдуцина в НСП не ниже 100 мкМ. Во-вторых, при экстракции GDP-содержащего трансдуцина из темноадаптированных НСП с помощью буферных растворов, содержащих различные концентрации Mg²⁺, переход Т_α-GDP в растворимую фракцию наблюдается только в присутствии 100 мМ Mg²⁺, причем Т_βγ в этом случае остается связанной с мембраной. Таким образом, при физиологических концентрациях Mg²⁺ и самого трансдуцина он скорее всего находится в виде ассоциата всех трех полипептидов, где Т_α-GDP связана Т_βγ, удерживающей ее на мембране.

С фотовозбужденным родопсином трансдуцин связан также в форме гетеротримера, в котором соотношение индивидуальных субъединиц соответствует 1:1:1, связь между его полипептидами и мембраной при этом значительно прочее, чем в темноадаптированных НСП. Однако замена связанного с трансдуцином GDP на GTP в процессе его активации дестабилизирует как связь между трансдуцином к родопсином, так и связь между самими субъединицами трансдуцина. Поэтому в присутствии GTP, особенно в гипотонической среде, все три полипептида переходят с фотовозбужденных мембран в растворимую фракцию. В том случае,
если для экстракции трансдуцина используют негидролизуемые аналоги GTP, тример легко может быть разделен с помощью ионообменной, гель-проникающей или аффинной хроматографии на Т_α, содержащую аналоги GTP, и Т_βγ.
Существенно, что Т_βγ при физиологических условиях не диссоциирует на Т_β и Т_γ, - для этого требуются денатурирующие условия, а также то, что при физиологической ионной силе, когда в растворимое состояние переходит преимущественно Т_α-GDP, Т_βγ в основном остается связанной с мембраной.

Таким образом, четвертичная структура гетеротримера весьма динамична: она более устойчива при темноадаптированном состоянии НСП и при взаимодействии GDP-содержащего трансдуцина с фотовозбужденным родопсином, но подвергается перестройке при связывании GTP (см. рис. 15). (Вопросы, связанные с изменениями четвертичной структуры в процессе активации трансдуцина, будут затронуты также при рассмотрении конкретных стадий активации трансдуцина фотовозбужденным родопсином).

Субъединицы трансдуцина обладают различной чувствительностью к протеолизу трипсином, причем доступность некоторых участков белка зависит от того, с каким нуклеотидом -GDP или GTP - он связан. Так Т_γ не гидролизуется трипсином независимо от того связан трансдуцин с GDP, фотовозбужденным родопсином или GTP. Т_β расщепляется трипсином на два фрагмента с молекулярной массой около 26 и 14 кД. В этом случае протеолиз также не зависит от связанного нуклеотида и фотовозбужденного родопсина. Заметим, что разрыв полипептидной цепи β-субъединицы не оказывает заметного влияния на GTP -связывающую и ГТФазную активность трансдуцина даже в том случае, если он реконструирован из интактной Т_α и препарата Т_βγ, в котором гидролизовано более 99% молекул Т_β.

В отличие от остальных субъединиц, чувствительность Т_α к триптическому гидролизу зависит от того, с каким нуклеотидом -GDP или GTP - она связана. Протеолиз Т_α протекает в несколько этапов. Сначала отщепляется фрагмент длиной 10-20 аминокислотных остатков с N-конца и около 40 остатков с С-конца молекулы, в результате остается фрагмент с молекулярной массой 32 кД. Дальнейший протеолиз этого фрагмента зависит от связанного нуклеотида: если Т_α была исходно связана с GDP то происходит дальнейшая деградация с образованием полипептидов 24 и кД; если же Т_α содержит негидролизуемый аналог GTP, то фрагмент 32 кД устойчив к дальнейшему протеолизу и прочно удерживает связанный нуклеотид, хотя и не способен служить активатором фосфодиэстеразы. Таким образом, можно полагать, что третичная структура трансдуцина, по крайней мере его α-субъединицы, значительно изменяется в процессе активации.

5.2. Активация трансдуцина родопсином

Процесс активации трансдуцина включает следующие стадии: связывание трансдуцина с фотовозбужденным родопсином; обмен связанного с трансдуцином GDP на экзогенный GTP; диссоциацию комплекса родопсин-трансдуцин (рис. 16).

Рис. 16. Схема взаимодействия трансдуцина с фотовозбужденным родопсином и гуаниловыми нуклеотидами

5.2.1. Связывание трансдуцина с родопсином

Процесс образования прочного комплекса между трансдуцином и фотовозбужденным родопсином можно регистрировать с помощью различных методических подходов.

В работах для изучения светозависимого связывания белков НСП с фоторецепторной мембраной предложен метод экстракции белков с помощью дифференциального центрифугирования в буферных растворах различной ионной силы с последующим анализом экстрактов и мембранной фракции путем ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле. С помощью этого подхода показано, что при физиологических значениях ионной силы и в отсутствие GTP трансдуцин ассоциирован с темноадаптированными мембранами НСП, при этом не имеет решающего значения конкретный ионный состав экстрагирующего раствора: 50-100 мМ Трис- HCl, фосфатный буфер, NaCl или КС1, а также 10-20 мМ MgCL₂ одинаково эффективно фиксируют трансдуцин на неосвещенной мембране фоторецепторных дисков. По-видимому, в этом случае трансдуцин ассоциирован преимущественно не столько с родопсином, сколько с липидным компонентом мембраны: при инкубации трансдуцина с искусственными фосфолипидными мембранами, в которых соотношение между родопсином и фосфолипидом варьирует в пределах от 1:100 до 1:500, эффективность связывания трансдуцина при умеренной ионной силе определяется содержанием липида, а не родопсина.

Понижение концентрации буферного раствора (например, до 5 мМ в случае с Трис-НСl-буфером) или, напротив, значительное повышение ионной силы по сравнению с физиологическими условиями снижает прочность связывания трансдуцина с темноадаптированными мембранами. В результате при центрифугировании он переходит с мембран во фракцию водорастворимых белков.

Иная картина наблюдается для освещенных НСП. В этом случае все три субъединицы трансдуцина оказываются необратимо связанными с фотовозбужденными мембранами не только при физиологической ионной силе, но и в гипотонических условиях или в растворах с высокой ионной силой. Прочное связывание трансдуцина обусловлено образованием его комплекса с фотовозбужденным родопсином; продолжительность существования комплекса определяется временем жизни фотовозбужденного пигмента, и после перехода последнего в опсин трансдуцин из комплекса диссоциирует. Связыванию трансдуцина с фотовозбужденным родопсином способствуют Mg²⁺ и Са²⁺ в концентрации свыше 0,2 мМ, а 1 мМ ЭДТА, напротив, вызывает десорбцию трансдуцина с темновых и фотовозбужденных мембран.

Следует особо подчеркнуть, что обязательное условие для скопления прочно связанного трансдуцина на фоторецепторных мембранах - это отсутствие в среде GTP; в присутствии GTP на свету комплекс родопсин-трансдуцин распадается (см. ниже).

В связывании с родопсином участвуют все три полипептида трансдуцина, то есть обе функциональные субъединицы Т_α и Т_αβγ. В пользу этого свидетельствует эквимолярность соотношения полипептидов трансдуцина, связанных с фотовозбужденнными мембранами, а также прямые эксперименты по взаимодействию Т_α-GDP и Т_αβγ с родопсин-содержащими протеолипосомами. В этих экспериментах показано, что алкилирование Т_α и Т_βγ с помощью ¹⁴С-этилацетимидата не влияет на активность трансдуцина и поэтому может быть использовано для непосредственного изучения взаимодействия меченых субъединиц с родопсином. При центрифугировали реакционной смеси, содержащей протеолипосомы с интегрированным в них родопсином и индивидуальные ¹⁴С-меченные Т_α или Т_βγ, каждая из субъединиц одинаково малоэффективно связывается с мембранами как в темноте, так и при освещении. Однако при одновременном добавлении субъединиц к родопсинсодержащим протеолипосомам эффективность светозависимого связывания полипептидов резко увеличивается и достигает максимума при их соотношении, равном 1:1.

Для регистрации образования комплекса трансдуцина с фотовозбужденным родопсином в реальном времени успешно применяется метод светорассеяния. В соответствии с этим методом измеряют быстрые изменения интенсивности рассеяния неактиничного света с длиной волны более 700 нм, которые происходят в суспензии НСП или в смеси фоторецепторных мембран и трансдуцина после кратковременной вспышки света (около 500 нм), вызывающей обесцвечивание заданного количества родопсина. Эти изменения протекают в пределах от десятков миллисекунд до нескольких секунд, в зависимости от конкретных экспериментальных условий и определенным образом зависят от местонахождения трансдуцина на мембранах. Показано, что в зависимости от присутствия GTP в среде инкубации освещение смеси фоторецепторные мембраны-трансдуцин вызывает два типа изменений светорассеяния: в отсутствие GTP наблюдается повышение светорассеяния системы, названное "сигналом связывания", в присутствии GTP светорассеяние снижается – это так называемый "сигнал диссоциации". Кроме того, при сильном обесцвечивании родопсина в отсутствие трансдуцина регистрируется небольшое быстрое снижение светорассеяния - "родопсиновый сигнал", в суспензии НСП его амплитуда прямо пропорциональна доле обесцвеченного родопсина и пренебрежимо мала по сравнению с амплитудами первых двух сигналов.

Остановимся подробнее на сигнале связывания (сигнал диссоциации будет расмотрен в разделе 5.2.3). Появление сигнала связывания отражает образование комплекса между фотовозбужденным родопсином и трансдуцином. Максимальная амплитуда сигнала наблюдается в суспензии разрушенных НСП при обесцвечивании 10% родопсина. Поскольку молярное соотношение родопсин: трансдуцин в НСП близко к 10:1, насыщение сигнала связывания при такой степени обесцвечивания соответствует количественному связыванию всего трансдуцина с фотовозбужденным родопсином в пропорции, близкой к 1:1. Скорость появления и амплитуда сигнала светорассеяния зависят от температуры, ионной силы и рН среды: при условиях, близких к физиологическим, амплитуда сигнала в НСП достигает максимума через 10 мс после вспышки, обесцвечивающей 8% родопсина.

Возможность надежной регистрации кинетики сигнала связывания позволила идентифицировать продукт фотолиза родопсина, способный связывать трансдуцин. Показано, что в интервале рН среды от 5,5 до 9 и температуры от 2 до 37°С кинетика сигнала светорассеяния определяется кинетикой образования метародопсина-II. Кроме того, в условиях, способствующих связыванию трансдуцина с родопсином, наблюдается накопление мета II - интермедиата. Так, в отсутствие трансдуцина при рН 8,3 и температуре 2°С затруднен переход родопсина из состояния мета-I в мета-II, но в присутствен трансдуцина одновременно наблюдается сдвиг равновесия мета-I « мета II в сторону образования метародопсина-II, связывание трансдуцина с фотовозбужденными мембранами и появление сигнала связывания. Наконец, после сильной вспышки, достаточной для связывания всего трансдуцина, повторное появление сигнала связывания возможно только после распада комплекса между родопсином и трансдуцином в результате фотолиза активированного родопсина. В этом случае оказывается, что кинетика восстановления сигнала связывания полностью совпадает с кинетикой распада метародопсина-II, яри этом скорость распада метародопсина-II под действием вязких концентраций гидроксиламина снижается, если он находится в комплексе с трансдуцином. Таким образом, трансдуцин связывается именно с метародопсином II и способствует стабилизации этого интермедиата фотолиза родопсина.

Измерение амплитуды сигнала связывания позволило рассчитать количественные параметры связывания трансдуцина с фотовозбужденным родопсином. В зависимости от того, находится трансдуцин в свободном состоянии или в комплексе с GDP, константа диссоциации комплекса трансдуцин-родопсин составляет соответственно 10^-9 или 10^-7 М (см. рис.16).

Пока не ясно, какие аминокислотные остатки обеспечивают прочное связывание трансдуцина с родопсином. Известно лишь то, что в этом взаимодействии принимает участие фрагмент молекулы родопсина, находящийся между 232-м и 248-м аминокислотными остатками, и, возможно, С-концевой участок родопсина (см. раздел 4). Что же касается трансдуцина, то известно, что для его связывания с фотовозбужденным родопсином необходимы аминокислотные остатки, локализованные в N- и (или) С-концевом фрагментах α-субъединицы, поскольку после кратковременного трипсинолиза, удаляющего небольшие участки с N- и С -концов, трансдуцин теряет способность связываться с фотовозбужденными мембранами НСП. По-видимому, важную роль в связывании трансдуцина с родопсином играют сульфгидрильные группы обоих белков. Модификация SH -групп трансдуцина N-этил-малеимидом не влияет на его взаимодействие с темноадаптированными мембранами, но препятствует образованию комплекса с обесцвеченным родопсином. Модификация остатков цистеина непосредственно в составе комплекса родопсин-трансдуцин при низких концентрациях алкилируюшего агента стабилизирует этот комплекс и нарушает его последующую GTP -зависимую диссоциацию, а при высоких (свыше1 мМ) концентрациях вызывает GTP-независимую диссоциацию инактивированного трансдуцина. Алкилирование одной-двух SH -групп родопсина в составе мембран НСП вызывает уграту его способности связывать трансдуцин.

Укажем также на то, что делипидизированный родопсин способен связывать трансдуцин и в растворе неионного детергента; отсюда можно полагать, что липидный компонент мембраны, по-видимому, не обязателен для образования прочного комплекса между этими белками.

5.2.2. GDP/GTP -обмен

Вторым этапом активации трансдуцина является переход трансдуцин- GDP → трансдуцин- GTP, который приводит к появлению у трансдуцина способности активировать ФДЭ.

В работах показано, что образование GTP-содержащего трансдуцина происходит за счет обмена нуклеотидов. Освещение мембран приводит к диссоциации связанного с трансдуцином GDP. В отсутствие экзогенных гуаниловых нуклеотидов диссоциация GDP из комплекса трансдуцина с мембранами наблюдается при фотолизе около 1% (и более) родопсина. Добавление GTP вызывает значительное повышение эффективности выброса связанного GDP: в присутствии 0,1 или 1 мкМ GTP полумаксимальный эффект наблюдается при дозе света, вызывающей фотовозбуждение соответственно 0,02 и 0,007% родопсина в препарате НСП. В присутствии меченого гуанилилимидодифосфата (ГИДФ) происходит одновременное высвобождение GDP и связывание с трансдуцином эквимолярного количества ГИДФ, причем молярное отношение числа центров, обменивающих нуклеотиды, к количеству фотовозбужденного родопсина достигает 500:1. Эти центры обменивают только GDP и GTP и не способны связывать другие нуклеотиды - GMP, АТР или UTP.

В качестве альтернативы общепринятому механизму образования GTP -содержащего трансдуцина путем GDP/GTP обмена был предложен механизм светозависимого трансфосфорилирования связанного с трансдуцином GDP (за счет экзогенных нуклеозидтрифосфатов), катализируемого нуклеозиддифосфаткиназной активностью, предположительно ассоциированной с Т_βγ субъединицей трансдуцина. Согласно этой гипотезе, процесс трансфосфорилирования GDP должен протекать значительно быстрее, чем GDP/GTP-обмен. Однако прямая проверка гипотезы о быстром трансфосфорилировании связанного с трансдуцином GDP, проведенная в работах, ее не подтвердила. Так, в присутствии GDP и АТР наблюдался сигнал связывания трансдуцина, характерный для образования прочного комплекса между не содержащим GTP трансдуцином и фотовозбужденным родопсином. Прямое сравнение скорости светозависимого выброса, связанного с трансдуцином ³Н-GDP в присутствии экзогенных нуклеозидтрифосфатов и скорости синтеза ³Н-GTP показало, что за время, достаточное для полной диссоциации связанного GDP, трансфосфорилирования не происходит. Таким образом, трансдуцин сам по себе не обладает трансфосфорилирующей активностью, и если все же она существует, то ее величина настолько мала по сравнению с интенсивностью светозависимого нуклеотидного обмена, что трансфосфорилирование не может служить альтернативой GDP/GTP- обмена.

Детальный кинетический анализ GDP/GTP -обмена на трансдуцине проведен в работе (см. рис. 16). В темновом состоянии нуклеотид-связывающий центр трансдуцина находится в закрытой конформации и содержит прочно связанный GDP (К_д = 0 М), не обменивающийся на экзогенные гуаниловые нуклеотиды. В составе комплекса с фотовозбужденным родопсином этот центр переходит в открытую конформацию, легко доступную для внешних гуаниловых нуклеотидов и со значительно более низким сродством к ним: К_д = 10-30,20 и 20-100 мкМ для GDP, GTP и ГИДФ соответственно. То есть сродство GDP к трансдуцину снижается в 100-300 раз, происходит его диссоциация из нуклеотид-связывающего центра, что делает возможным вхождение туда другого гуанилового нуклеотида. В свою очередь, связывание GTP (или его негидролизуемого аналога) вновь вызывает конформационную перестройку белка: его сродство к метародопсину- II многократно снижается, а сродство к связанному GTP значительно возрастает по сравнению с открытой конформацией (кажущаяся константа диссоциации комплекса трансдуцин-GTP составляет 10^-710^-8 М).

Для связывания трансдуцина с гуаниловыми нуклеотидами необходимы ионы Mg²⁺. ЭДТА нарушает светозависимое связывание GTP, более того, в присутствии комплексообразовагеля наблюдается не зависящая от света диссоциация предварительно связанного нуклеотида. Следует подчеркнуть, что в процессе активации трансдуцина катион Mg²⁺ играет двоякую роль: он необходим, во-первых, для связывания трансдуцина с фотовозбужденным родопсином, и, во-вторых для связывания трансдуцина с нуклеогидом, который, по-видимому, удерживается в нуклеотид-связывающем центре только в виде комплекса с Mg²⁺. Катионы Mn²⁺ и Co²⁺, подобно ионам Mg²⁺, стимулируют связывание GTP с трансдуцином, a Zn²⁺ и Cd²⁺ - ингибируют его.

В работе показано, что модулятором связывания GDP и GTP с трансдуцином может служить cGMP. Взятые в эквимолярных количествах, GDP и GTP конкурируют за один и тот же нуклеотидсвязывающий центр; добавление 0,2-2,0 мМ cGMP стимулирует связывание GTP и ингибирует связывание GDP, изменяя соотношение в пользу GTP-содержащего трансдуцина. Необходимо отметить, однако, что реальная концентрация cGMP в НСП по крайней мере в 10 раз ниже указанной и едва ли может существенно влиять на нуклеотидный обмен in vivo, тем более, что в реальной ситуации и концентрация GTP намного выше концентрации GDP (см. раздел 2).

Таким образом, обмен связанного с трансдуцином GDP на экзогенный GTP происходит в результате того, что прочное связывание трансдуцина с метародопсином-II приводит к конформационной перестройке нуклеотид-связываюшего центра Т_α, и, как следствие, - к снижению его сродства к GDP в сотни раз. В итоге GDP диссоциирует из комплекса с белком, а его место занимает GTP, причем связывание GTP переводит трансдуцин в закрытую конформацию с высоким сродством к нуклеотиду.

Однако для завершения процесса активации необходима диссоциация трансдуцина из комплекса с родопсином для того, чтобы описанный акт активации мог повториться еще несколько сот раз.

5.2.3. Диссоциация комплекса родопсин-трансдуцин

Конформационный переход трансдуцина, вызванный связыванием GTP, нарушает прочность его комплекса с фотовозбужденным родопсином: добавление GTP или его негидролизуемых аналогов к суспензии фоторецепторных мембран, содержащих прочно связанный трансдуцин, приводит к полной диссоциации комплекса. В результате после центрифугирования суспензии мембран при l00000g трансдуцин оказывается в надосадочной жидкости. Аналогичный эффект наблюдается, если к суспензии мембран одновременно добавляют GDP и АТР, так как с фоторецепторной мембраной ассоциирована GDP-киназная активность, катализирующая образование GTP непосредственно в реакционной смеси.

Процесс GTP-зависимой диссоциации трансдуцина из комплекса с родопсином может быть зарегистрирован в реальном времени путем измерения светорассеяния суспензии фоторецепторных мембран или нативных НСП подобно тому, как делается по сигналу связывания при образовании комплекса родопсин-трансдуцин. В отличие от метода центрифугирования измерение светорассеяния позволяет непосредственно наблюдать кинетику диссоциации трансдуцина в течение десятков миллисекунд после вспышки света.

Освещение суспензии фоторецепторных мембран, содержащей трансдуцин и GTP, вызывает уменьшение светорассеяния системы. Этот эффект получил название "сигнал диссоциации", поскольку он коррелирует с переходом трансдуцина с мембран в растворимую фракцию. Таким образом, сигнал диссоциации, заключающийся в уменьшении светорассеяния суспензии, направлен в противоположную сторону по сравнению с сигналом связывания.

В пользу того, что сигнал диссоциации действительно отражает процесс образования активированного GTP-содержащего трансдуцина, свидетельствуют следующие факты. Сигнал диссоциации наблюдается в условиях, которые приводят к десорбции трансдуцина - после добавления GTP или тогда, когда он синтезируется непосредственно в реакционной смеси. Амплитуда сигнала увеличивается при физиологических значениях ионной силы, т.е. в условиях, когда трансдуцин преимущественно ассоциирован с темноадаптированной мембраной, и уменьшается с гипотонической среде, когда трансдуцин в основном уже находится не на мембранах, а в растворе; иными словами, сигнал диссоциации реально отражает распределение трансдуцина между мембраной и водной фазой. Наконец, при одновременном измерении сигнала Диссоциации и активности фосфодиэстеразы в реакционной смеси однозначно показано, что степень активации фосфодиэстеразы коррелирует с относительной величиной амплитуды сигнала диссоциации, то есть амплитуда сигнала отражает количество образовавшегося активированного трансдуцина.

Следует также указать на то, что амплитуда сигнала диссоциации при физиологической ионной силе определяется в основном изменением количества α-субъединицы трансдуцина, ассоциированной с фоторецепторной мембраной.

В отличие от сигнала связывания, амплитуда которого достигает максимума при обесцвечивании эквимолярного трансдуцину количества родопсина (для НСП это 10°/о-ное обесцвечивание), максимальная амплитуда GTP -зависимого сигнала диссоциации достигается при соотношении родопсин: трансдуцин менее, чем 1:100 (при обесцвечивании менее 0,1% родопсина в НСП) благодаря способности каждой молекулы фотовозбужденного родопсина катализировать активацию нескольких сотен молекул трансдуцина.

Таким образом, метод светорассеяния позволяет вполне адекватно судить о появлении в реакционной смеси активированного трансдуцина. Его важное преимущество по сравнению с другими методами – возможность регистрации процесса активации трансдуцина за очень небольшие промежутки времени, сопоставимые с временем генерации фото рецепторного ответа, причем это можно делать непосредственно на препаратах интактного НСП. Такой анализ позволяет оценить скорость образования активированного трансдуцина in vivo, а это важно, т.к. реконструированные системы содержат сильно разбавленные компоненты фоторецепторного аппарата, которые к тому же могут быть частично инактивированными при получении бесклеточных экстрактов. В результате сделанные оценки могут оказаться заниженными в сравнении со скоростью активации трансдуцина. Например, оценка с помощью измерения сигнала диссоциации в суспензии мембран НСП дает величину каталитической константы для активации трансдуцина фотовозбужденным родопсином около 10^-1. Эта величина слишком мала, чтобы обеспечить активацию сотен молекул трансдуцина in vivo за времена фоторецепторного ответа клетки (около секунды). Однако при измерении сигнала диссоциации непосредственно на интактных НСП, ориентированных в магнитном поле, оказалось, что скорость активации трансдуцина характеризуется каталитической константой порядка 1000 с^-1 т.е. светозависимая активация нескольких сотен молекул трансдуцина в НСП происходит за время порядка сотен миллисекунд, что согласуется с периодом генерации фоторецепторного ответа клетки.

Важно отметить, что именно при диссоциации GTP -транс-комплекса с родопсином процесс его активации становится необратимым. Кинетический анализ, проведенный в работе показал, что диссоциация GTP –содержащего трансдуцина протекает в две стадии: сначала связывание GTP изменяет конформацию трансдуцина и резко снижает его сродство к родопсину, затем наблюдается быстрая необратимая стадия, которая, как полагают, представляет собой диссоциацию GTP-содержащего трансдуцина на субъединицы Т_α-GDP и Т_βγ (см. рис. 16)

Таким образом, активация молекулы трансдуцина, включающая ее связывание с фото возбужденным родопсином, обмен GDP на GTP и диссоциацию активированного трансдуцина, занимает несколько миллисекунд, приводя к появлению Т_α-GDP-активатора ФДЭ. Замыкание цикла активации трансдуцина происходит благодаря тому, что он обладает собственной ГТФазной активностью.

5.3. ГТФаза трансдуцина

ГТФазная активность трансдуцина была впервые обнаружена в работе. Как выяснилось, НСП содержит два типа ГТФазы, различающихся по сродству к GTP: одна из них гидролизует GTP и ATP (K_m = 10^-4) независимо от света, другая - активируется светом и специфична по отношению к GTP (кажущаяся K_m около 10^-6 М); последняя активность принадлежит трансдуцину.

Оптимальные значения рН для гидролиза GTP ГТФазой трансдуцина лежат в области 7,5-8,0. Реакция протекает при обязательном участии ионов Mg²⁺ поскольку в активный центр грансдуцина нуклеогвд входит именно в виде комплекса с Mg²⁺. Mg²⁺ может быгь заменен на Mn²⁺ или Co²⁺,в то время как Ca²⁺ и Zn²⁺ ингибируют ГТФазу.

Гидролиз связанного GTP протекает, по-видимому, только на α-субъединице трансдуцина, однако для проявления его светозависимой ГТФазной активности необходимо присутствие обеих функциональных субъединиц - Т_α и Т_βγ. В реконструированной бесклеточной системе, содержащей различное количество Т_α и Т_βγ скорость светозависимого гидролиза GTP прямо пропорциональна концентрации Т_α. В то же время концентрация Т_βγ достаточная для максимальной скорости гидролиза GTP, составляет не более 10% от содержания Т_α, то есть Т_βγ по отношению к Т_α может присутствовать в каталитических количествах. Вероятнее всего это связано с тем, что каждая Т_βγ способна последовательно участвовать в GTP-зависимой активации нескольких α-субъединиц, не вовлекаясь непосредственно в акт гидролиза GTP. В пользу такого механизма свидетельствует и то, что 100-кратное разбавление бесклеточной системы, содержащей трансдуцин- GTP, не оказывает заметного влияния на скорость гидролиза GTP на трансдуцине. Продуктами гидролиза GTP в активном центре трансдуцина служат GDP, который остается прочно связанным с белком, и свободный неорганический фосфат, быстро диссоциирующий из комплекса с трансдуцином.

Гидролиз GTP представляет собой наиболее медленную стадию в цикле активации трансдуцина. Как уже отмечалось выше, связывание трансдуцина с фотовозбужденным родопсином, нуклеотидный обмен и диссоциация комплекса родопсин трансдуцин в сумме занимают по оценкам in vitro от 0,1 до 0,001 с, в то время как число оборотов для ГТФазы, по данным разных авторов, колеблется в пределах от нескольких секунд до 1,5 мин, чаще всего приводятся значения 10-30 сек. Возможная роль ГТФаза трансдуцина в регуляции фосфодиэстеразного каскада будет также рассмотрена в разделе 7.

5.4. Активация трансдуцина фторидом алюминия

Существует возможность имитации in vitro перехода трансдуцина в активированное состояние без участия светозависимого связывания GTP,. Речь идет об эффекте, вызываемом ионами AlF₄^-.

В присутствии 1-10 мМ NaF или KF и 10-100 мкМ АlСl₃, то есть в условиях, когда алюминий преимущественно находится в виде аниона AlF₄^-, наблюдаются подавление светозависимого GDP/GTP- обмена, необратимая десорбция трансдуцина с поверхности темноадаптированных фоторецепторных дисков и активация ФДЭ в темноте. При этом α-субъединица трансдуцина, экстрагированного с поверхности мембран с помощью AlF₄^-, по своей доступности для действия трипсина аналогична Т_α, содержащей негидролизуемый аналог GTP. Иными словами, в присутствии фторида алюминия трансдуцин переходит в состояние, аналогичное активированному комплексу трансдуцина с GTP.

Эффект AlF₄^- наблюдается только в том случае, если в нуклеотидсвязываюшем центре трансдуцина находится связанный GDP: в отсутствии GDP или при его замене на гуано-зин-5-0-(3-тиодифосфат) AlF₄^-зависимая активация трансдуцина подавлена.

Концентрационные зависимости для активации трансдуцина ионами ACl₃⁺ и F^- говорят о том, что AlF₄^- связывается с трансдуцином в эквимолярном соотношении. Анион AlF₄^- пространственная структура которого во многом сходна со структурой аниона фосфата, по-видимому, занимает место γ-фосфата в нуклеотидсвязывающём центре Т_α в непосредственной близости от GDP, имитируя наличие GTP в составе центра.

5.5. ADP -рибозилирование трансдуцина

α-Ρсубъединица трансдуцина может ADP -рибозилироваться двумя бактериальными токсинами - холерным и коклюшным, с использованием NAD⁺ в качестве донора ADP-рибозильного остатка.

В случае с холерным токсином остаток ADP -рибозы переносится с NAD⁺ на Arg¹⁷⁴ трансдуцина, и эта ковалентная модификация приводит к 20-кратному ингибированию ГТФазной активности трансдуцина. Реакция ADP-рибозилирования протекает в присутствии фотовозбужденных мембран, обеих функциональных субъединиц Т_α и Т_βγ, стимулируется GTF или ГИДФ и ингибируется избытком GDP. Таким образом, имеющиеся данные указывают на то, что ADP -рибозилирование холерным токсином фиксирует трансдуцин в активированном состоянии, тормозя гидролиз GTP в его активном центре.

ADP -рибозилирование коклюшным токсином модифицирует остаток Cys³⁴⁷ в Т_α. Присоединение ADP -рибозильной группы происходит в темноте, стимулируется избытком GDP, а негидролизуемые аналоги GTP на свету его подавляют. В результате модификации коклюшным токсином трансдуцин теряет способность к GDP/GTP-обмену и остается в GDP -связанном состоянии, в котором, естественно, не обладает ГТФазной активностью и способностью активировать ФДЭ.

Связывание AlF₄^- с GDP-трансдуцином имитирует связывание GTP и, аналогично GTP, AlF₄^- ингибирует ADP-рибозилирование трансдуцина, катализируемое коклюшным токсином.

5.6. Трансдуцин в семействе GTP -связывающих белков

Семейство регуляторных GTP -связывающих белков насчитывает в своем составе достаточно много представителей. Общим свойством таких белков, независимо от того, какие конкретные функции в клетке они выполняют, является то, что их переход из неактивного состояния в активное происходит только в результате GDP/GTP-обмена под действием внешнего стимула, в роли которого могут выступать какой-либо рецептор или другой регуляторный белок, а возврат в неактивное состояние - в результате гидролиза связанного GTP до GDP. Общие принципы функционирования обусловливают более или менее выраженное сходство трансдуцина из НСП с другими GTP -связывающими белками. Различных аспектов этого сходства мы и коснемся в данном разделе.

5.6.1. Межвидовое сходство трансдуцина

Трансдуцин у позвоночных – весьма консервативный белок. Об этом свидетельствуют, во-первых, данные иммунологического анализа: антитела, полученные против трансдуцина из НСП быка, связываются с фоторецепторными мембранами из НСП крысы, свиньи, лягушки, ящерицы и цыпленка; хотя с фоторецепторными мембранами беспозвоночных они не взаимодействуют.

Электрофоретический анализ очищенных препаратов трансдуцина показывает, что трансдуцин млекопитающих, птиц и земноводных имеет одинаковый субъединичный состав, однако субъединицы трансдуцина у земноводных, по-видимому, более склонны к агрегации, чем у млекопитающих и птиц. Анализ триптических гидролизатов трансдуцина, полученного от представителей разных классов позвоночных, демонстрирует очевидное сходство их пептидных карт.

Наконец, налицо не только структурное, но и функциональное сходство: трансдуцин от разных видов и классов позвоночных эффективно активируется фотовозбужденными мембранами из НСП быка.

5.6.2. Колбочковый трансдуцин

Ближайший "родственник" грансдуцина НСП- GTP -связывающий белок из наружных сегментов колбочек сетчатки. Целесообразно несколько подробнее остановиться на экспериментальном подходе, который привел к обнаружению этого белка. В процессе определения первичной структуры α-субъединицы трансдуцина из НСП быка Lerea и соавт. на основе частичного секвенирования белка синтезировали олигонуклеотидный зонд, с помощью которого были получены и проклонированы два фрагмента ДНК. Из них один соответствовал гену трансдуцина, а другой имел последовательность, на 80% идентичную нуклеотидной последовательности трансдуцина. Затем синтезировали олигопепгиды, соответствующие различным последовательностям этих двух генов, и использовали для получения моноспецифических антител. Антитела в экстрактах сетчатки связывали соответственно α-субъединицу грансдуцина или белок с молекулярной массой 41 кД. При иммунофлуоресцентном окрашивании эти антитела окрашивали соответственно НСП или наружные сегменты колбочек. Таким образом, в наружных сегментах колбочек, присутствует белок, похожий на трансдуцин. GTP -связывающий белок колбочек предложено называть "трансдуцин II" в отличие от "трансдуцина I", т.е. трансдуцина НСП. Иммунохимическое различие этих белков подтверждается тем, что получены антитела против α-субъединицы палочкового трансдуцина. которые не окрашивают колбочки.

О функциональных характеристиках GTP -связывающего белка из колбочек пока практически ничего не известно.

5.6.3. N-белки гормонзависимой аденилатциклазы

Трансдуцин относится к группе GTP -связывающих белков, участвующих в передаче регуляторных сигналов. В связи с этим объектом пристального внимания специалистов служит проблема возможной аналогии между трансдуцином и GTP -вязывающими белками, участвующими в передаче гормональных сигналов от гормон-рецепторных комплексов к мембранной аденилатциклазе (рис. 17).

Проблема регуляции аденилатциклазы затрагивает столь обширную область исследований, что мы лишены возможности сколько-нибудь детально рассмотреть ее в данном обзоре, и поэтому придется ограничиться только очень кратким, схематичным описанием механизма сопряжения аденилатциклазы гормон-рецепторным комплексом через GTP -связывающие белки.

В регуляции аденилатциклазы участвуют по крайней мере два GTP -связывающих белка. Один из них активирует аденилатциклазу - это стимуляторный белок, обозначаемый как G_S или N_S (далее - N_S). Другой белок, подавляющий активность фермента, носит название ингибиторный белок и для его обозначения используют символы G_i или N_i (мы будем использовать в данном разделе обозначение N_i).

Если рассмотреть регуляцию аденилатциклазы на примере рецепции катехоламинов, то краткая схема сопряжения фермента с гормонрецепторными комплексами при участии N-белков будет выглядеть следующим образом: связывание гормон-с β-адренергическим рецептором вызывает его переход в возбужденное состояние, находясь в котором рецептор активирует стимуляторный белок N_s, и тот, в свою очередь, повышает активность аденилатциклазы; в противоположность этому α₂ -рецептор, связав агонист, активирует ингибиторный белок N_i, который подавляет активность фермента. Активация N-белков происходит за счет того, что при взаимодействии с рецептором они теряют связанный с ними GDP и обменивают его на прочно связанный GTP. Обратный переход в неактивное состояние происходит в результате гидролиза связанного GTP до GDP и неорганического фосфата (см. рис. 17).

Рис. 17. Схема регуляции аденилатциклазы (а) и фосфодиэстеразы cGMP (б) с участием регуляторных GTP -связывающих белков

Таким образом, принципиальная схема регуляции метаболизма циклических нуклеотидов с участием трансдуцина или N-белков выглядит следующим образом: внешний стимул (свет или гормон) действует на рецепторный белок родопсин или рецептор гормона); активированный рецептор взаимодействует с GTP-связывающим белком (трансдуцином N_s или N_i и вызывает обмен связанного с ним GDP на GTP; GTP-связывающий белок, связав GTP, переходит в активное состояние и в свою очередь становится эффектором фермента, участвующего в метаболизме циклических нуклеотидов (т.е. фосфодиэстеразы или аденилатциклазы); активность ферментативного каскада возвращается к базальному уровню, благодаря тому, что все эти GTP-связываюшие белки обладают собственной ГТФазной активностью.

Столь явное сходство принципов гормональной и зрительной рецепции стимулировало интенсивные поиски аналогии между GTP -связывающими белками обеих систем.

N-белки очень похожи на трансдуцин по своей структуре: по данным электрофоретического анализа N-белки тоже состоят из трех полипептидов (α, β θ γ), μолекулярные массы которых в случае с N_s составляют соответственно 52, 37 и менее 10 кД, а в случае N_i – соответственно 39, 37 и менее 10 кД.

Первичная структура α-субъединиц N_s и N_i совпадает с аминокислотной последовательностью T_α соответственно на 38 и 58%.

Аминокислотные последовательности β-субъединиц трансдуцина и N-белков, по-видимому, полностью идентичны, при этом кодирующие последовательности соответствующих мРНК одинаковы, но эти мРНК отличаются некодирующими участками.

Полагают, что мРНК β-субъединиц указанных белков считывается с одинаковых генов, но процесс их сплайсинга протекает по-разному.

Идентичность β-субъединиц GTP-связывающих белков утверждается также данными иммунохимического анализа: антитела, полученные против T_β, реагируют и с β-субъединицами N-белков. Триптические и химотриптические фрагменты β-субъединиц у GTP-связывающих белков также одинаковы, независимо от того, в каких условиях производится протеолиз - на мембранных препаратах или с использованием очищенных белков. Иными словами, - субъединицы N-белков и трансдуцина не только идентичны, но и одинаковым образом экспонированы на мембране.

Вместе с тем γ-субъединицы N-белков отличаются от соответствующего полипептида трансдуцина. Пептидные карты γ-субъединиц N_s и N_i полностью совпадают между собой, но не с пептидной картой γ-субъединицы трансдуцина. Антитела против T_γ не связываются с γ-субъединицами N-белков. N-белки после активации гормон-рецепторным комплексом диссоциируют на α-GTP и βγ-ρубъединицы подобно тому, как это происходит в случае с трансдуцином, при этом N_s и N_i способны обмениваться своими βγ-ρубъединицами. В отличие от T_βγ, βγ-ρубъединица N -белков гидрофобна, для ее экстракции из мембран необходимо использовать детергенты, что повидимому, обусловлено большей гидрофобностью γ-субъединицы. Наконец, клоны кДНК, содержащие последовательность, кодирующую γ-субъединицу трансдуцина, не гидридизуются с мРНК из клеток, продуцирующих N-белки.

α-Ρубъединицы N-белков имеют высокую степень гомологии с теми участками T_α, которые предположительно участвуют в формировании нуклеотид-связываюшего центра. N-Белки подобно трансдуцину подвергаются ADP-рибозилированию в присутствии бактериальных токсинов, но в отличие от трансдуцина, α-субъединица которого модифицируется как холерным, так и коклюшным токсинами, α-субъединицы разных N-белков могут служить субстратом только для одного из токсинов: холерный токсин ADP-рибозилирует α-субъединицу N_s, а коклюшный - α-субъединицу N_i. ADP-рибозилирование N -белков этими токсинами оказывает такой же эффект на механизм их активации, как и модификация трансдуцина в соответствующих случаях: модификация холерным токсином фиксирует его в активированной GTP-содержащей форме, препятствуя гидролизу GTP в активном центре, а ADP рибозилирование коклюшным токсином, напротив, препятствует обмену связанного GDP на GTP.

Аналогия между трансдуцином и N-белками распространяется не только на структуру, но и на функцию этих белков, что делает некоторые компоненты аденилатциклазной и фосфодиэстеразной систем функционально взаимозаменяемыми. Впервые об этом сообщалось в работах, где приводились данные о том, что фотовозбужденный родопсин, находясь в составе мембран НСП, может активировать аденилатциклазу, сопряженную с N_s-белком, в препарате плазматической мембраны эритроцитов.

Более поздние работы не подтвердили способность родопсина активировать аденилатциклазу через N_s-белок, но показал, что действительно существует функциональное сходство между трансдуцином и N-белком, только не стимулярным, а ингибиторным: β-адренергические рецепторы, реконструированные в составе протеолипосом, в ответ на связывание агониста активируют ГТФазную активность белка N_s, но не влияют на ГТФазную активность N_i и трансдуцина; в то же время протеолипосомы, содержащие родопсин и трансдуцин или N_i, демонстрируют одинаково высокую светозависимую ГТФазную активность, в отличие от протеолипосом, содержащих родопсин и N_s.

Удалось осуществить полную реконструкцию N_i и трансдуцина из гетерологичных субъединиц. При этом показано, что фотовозбужденный родопсин эффективно активирует не только N_i, но и химерные белки, состоящие из α-субъединицы N_i и Т_βγ или из Т_α и βγ-ρубъединицы N_i.

Одна из наиболее популярных моделей регуляции аденилатциклазы основана на предположении, что ее активация обусловлена непосредственным взаимодействием с GTP -содержащей α-субъединицей N_s, образующейся в результате GTP- зависимой диссоциации тримера субъединиц N-белка; напротив, GTP -зависимая активация N_i белка, также приводящая к его диссоциации, вызывает значительное повышение концентрации свободной βγ-ρубъединицы, которая связывает активированную α-субъединицу стимуляторного белка и способствует ее конкурентному вытеснению из комплекса с аденилатциклазой. Оказалось, что в полном соответствии с этой гипотезой добавление Т_βγ в бесклеточную систему, содержащую активированную аденилатциклазу, ингибирует активность фермента, имитируя эффект βγ-ρубъединицы N-белка.

Таким образом, многочисленные данные говорят о глубоком сходстве трансдуцина и N-белков аденилатциклазной системы как в структурном, так и в функциональном отношении, при этом их функциональное сходство заходит столь далеко, что в модельных условиях трансдуцин способен выполнять роль компонента аденилатциклазной системы.

5.6.4. Трансдуцин и некоторые другие GTP-связывающие белки

Имеется определенное сходство трансдуцина и с некоторыми другими GTP -связывающими белками. В первую очередь то относится к белку N₀ (или G₀). Функция этого белка на сегодняшний день не вполне понятна, но он, по-видимому, подобно N_s и N_i -белкам, может участвовать в передаче гормональных сигналов в мозговой ткани. N₀ состоит из трех полипептидов – α, β, γ, οричем его β- и γ- субъединицы полностью идентичны соответствующим полипептидам N_s и N_i -белков. Следовательно, β-субъединица также идентична β-субъединице трансдуцина. Кроме того, аминокислотная последовательность α-субъединицы N₀ -белка (ее масса 39 кД) на 60% совпадает с первичной структуре α-субъединицы трансдуцина.

Наблюдается также сходство между достаточно протяженными фрагментами аминокислотных последовательностей Т_α и белка p21^ras, а также фактора элонгации EF-Tu; эти фрагменты предположительно участвуют в формировании GTP-связывающих центров указанных белков. Данные о специфичности связывания различных аналогов GTP и GDP с белками указывают на то, что GTP -связывающие центры трансдуцина и EF-Tu имеют одинаковую стереоселективность по отношению к α-фосфорильной группе GTP, но разную - по отношению к β-фосфорильной группе.

На этом мы заканчиваем рассмотрение свойств трансдуцина и тех процессов, в результате которых при его взаимодействии с фотовозбужденным родопсином в НСП появляется T_α-GTP- белок, регулирующий активность фосфодиэстеразы. О том, как происходит взаимодействие активированного трансдуцина с ФДЭ, а также о свойствах самого фермента, будет подробно рассказано в следующем разделе.

6. ФОСФОДИЭСТЕРАЗА

ФДЭ (3',5'-циклонуклеотид-5'-нуклеотидгидролаза) впервые была обнаружена Bitensky и соавт. ФДЭ катализирует гидролиз 3',5'-cGMP в НСП в ответ на активацию трансцуцином и представляет собой конечное звено светозависимого каскада родопсин-трансдуцин- ФДЭ. В темноадаптированных НСП ФДЭ характеризуется низкой активностью, которая значительно возрастает при взаимодействии с белком-регулятором, в качестве которого выступает трансдуцин, активированный фотовозбужденным родопсином.

6.1. Структура и локализация ФДЭ

ФДЭ представляет собой белок с молекулярной массой 170-220 кД, который имеет изоэлектрическую точку при pH 5,7 и состоит из трех полипептидов – α, β θ γ. Μолекулярная масса α-субъединицы, по оценкам разных авторов, варьирует в пределах 85-95 кД, молекулярная масса β-субъединицы как правило на 2-4 кД ниже, γ-субъединица значительно меньше остальных попипептидов, входящих в состав ФДЭ, - ее молекулярная масса по данным электрофореза достигает 10-13 кД.

Рис.18. Последовательность аминокислот в молекуле γ-субъединицы ФДЭ

Сравнение пептидных карт α- и β-субъединиц ФДЭ позволяет полагать, что β-субъединица представляет собой продукт частичного протеолиза и α-субъединицы.

Для γ-субъединицы ФДЭ из НСП быка путем прямого секвенирования белка и параллельного секвенирования соответствующей кДНК определена полная аминокислотная последовательность. Из анализа первичной структуры γ-субъединицы (рис. 18) следует, что в ее состав входит 87 остатков аминокислот (N-концевая аминогруппа ацетилирована) молекулярная масса полипептида, рассчитанная на основании его первичной структуры, равна 9,7 кД.

Каталитический центр фермента образован αβ-δимером, γ-субъединица выполняет роль ингибитора активности ФДЭ - об этом подробнее будет сказано ниже.

ФДЭ локализована на цитоплазматической поверхности фоторецепторных дисков, она не является интегральным белком фоторецепторной мембраны, и прочность ее связывания с мембраной зависит от ионной силы среды: при физиологических значениях ионной силы и в присутствии Mg²⁺ фермент ассоциирован с фоторецепторными дисками, но переходит в растворимую фракцию при инкубации в гипотоническом буферном растворе или в присутствии хелаторов Mg²⁺. При ионных условиях интактной клетки вся ФДЭ ассоциирована с мембраной. Показано, что количество ФДЭ, связанной на содержащих родопсин протеолипосомах, определяется содержанием в них липида, а не родопсина, и, следовательно, ФДЭ связана с липидным компонентом фоторецепторной мембраны. В отличие от трансдуцина, прочность связывания ФДЭ с фоторецепторной мембраной не зависит от света: при понижении ионной силы ФДЭ одинаково эффективно диссоциирует как с темноадаптированных, так и с фотовозбужденных мембран НСП.

6.2. Каталитические свойства ФДЭ

Каталитическую активность ФДЭ измеряют либо путем определения продуктов гидролиза радиоактивного циклического нуклеотида, либо путем непрерывной регистрации гидролиза субстрата с помощью рН -метрии. В первом случае препараты ФДЭ инкубируют в присутствии меченого cGMP и после остановки реакции кипячением обрабатывают реакционную смесь 5'-нуклеотидазой змеиного яда для превращения продукта фосфодиэстеразной реакции (5'- GMP) в меченый гуанозин; затем пропускают инкубационную смесь через небольшую колонку с ДЭАЭ-Сефадексом для отделения гуанозина от cGMP и определяют количество меченого гуанозина путем жидкостного сцинтилляционного счета. Второй способ основан на том, что при гидролизе фосфодиэфирной связи в молекуле GMP происходит высвобождение протона, поэтому за ходом фосфодиэстеразной реакции можно наблюдать по изменению рН реакционной смеси либо непосредственно с помощью рН - электрода, либо колориметрически, используя рН- чувствительные индикаторные красители.

Фосфодиэстеразная реакция с НСП в темноте и на свету прогекает с разной скоростью: в темноадаптированных НСП более чем 95% молекул ФДЭ находится в ингибированном состоянии; при освещении в присутствии GTP каталитическая активность ФДЭ может возрастать более чем в 50 раз и по разным оценкам достигать 600-4000 молей cGMP/моль ФДЭ-сек.

Как в и ингибированном, так и в активированном состоянии фермент специфичен в отношении cGMP; cAMP также может служить субстратом, хотя сродство ФДЭ к сАМР значительно ниже, чем к cGMP. Величины константы Михаэлиса, измерение в разных работах, варьируют 80 до 360 мкМ для cGMP и от 2,3 до 8 мМ - для сАМР. В среднем К_m для cGMP составляет около 10^-4 М.

Имеются сообщения о том, что сродство ФДЭ к субстрату снижается в 8 раз при адаптации НСП к свету, при этом К_m cGMP достигает 1,5 мМ. Этот эффект наблюдается только в грубых препаратах НСП, в то время как в конструированных системах, содержащих отмытые мембраны НСП, трансдуцин и ФДЭ, сродство ФДЭ к cGMP в темноте и при освещении не изменяется (К_m = 10^-4 М). Кроме того, в препаратах НСП, подвергнутых замораживанию-оттаиванию и обработанных фосфолипазой, при адаптации к свету также не происходит снижения сродства ФДЭ к субстрату. Предполагают, что изменение сродства фермента к cGMP в условиях адаптации к свету опосредовано лабильным белком, присутствующим в интактных мембранах НСП.

Кроме каталитического центра, в котором гидролизуется сGМР, ФДЭ, по-видимому, имеет дополнительные некаталитические центры связывания cGMP с высоким сродством, характеризующиеся константами диссоциации 160 и 800 нМ. В отличие от каталитического центра, некаталитические центры связывают cGMP в присутствии высоких концентраций конкурентного ингибитора ФДЭ - изобутилметилксантина, они более лабильны и эффективность связывания в них cGMP не зависит от света. Вместе с тем функциональная роль этих центров в регуляции ФДЭ неясна, более того, некаталитическое связывание cGMP не влияет на эффективность светозависимого гидролиза циклического нуклеотида.

Для активности ФДЭ необходимы ионы Mg²⁺, их оптимальная концентрация лежит в интервале от 0,1 до 10 мМ. Добавление ЭДТА полностью ингибирует ФДЭ. Катионы Mn²⁺, хотя и менее эффективно, могут заменять Mg²⁺, в то время как другие двухвалентные катионы - Be²⁺, Ni²⁺, Са²⁺, Zn²⁺, Co²⁺, Fe²⁺, Рb²⁺ - конкурируя с Mg²⁺, ингибируют ФДЭ. ФДЭ не регулируется кальмодулином в интервале от 10^-8 до 10^-3 М Са²⁺. Са²⁺ оказывает ингибирующий эффект при концентрациях около 0,1-1 мМ, что значительно выше нормального физиологического уровня, при более низких концентрациях он не влияет на активность ФДЭ.

Активность очищенной ФДЭ ингибируется высокими концентрациями нуклеозидтрифосфатов: величины K_i для GTP и АТР составляют около 0,5 мМ.

Поликатионы, такие как гистоны и протамин, стимулируют активность ФДЭ независимо от того, находится она в составе мембран НСП или в виде очищенного препарата; ни фотовозбужденный родопсин, ни GTP не требуются для активации фермента поликатионами.

В присутствии S-аденозилметионина в качестве донора мегильной группы в препаратах НСП происходит метилирование α-субъединицы ФДЭ, однако, в какой мере эта ковалентная модификация влияет на активность фермента, неясно.

6.3. Механизм активации ФДЭ

6.3.1.γ-ρсубъединица ФДЭ

Уже в одной из первых работ, посвященных выделению светозависимой ФДЭ из НСП, было обнаружено, что активность фермента резко возрастает, после кратковременной инкубации в присутствии трипсина. Этот эффект наблюдается как на препаратах НСП, так и для гомогенной ФДЭ, и не зависит от присутствия фотовозбужденного родопсина и гуаниловых нуклеотидов, причем активность обработанной трипсином ФДЭ как правило превышает уровень светоактивированного фермента.

Механизм активации ФДЭ трипсином детально исследован Hurley и Stryer. Сопоставление изменения активности фермента в процессе протеолиза с изменением электрофоретического поведения его субъединиц показывает, что при кратковременном протеолизе, достаточном для полной активации ФДЭ, избирательно разрушается ее γ-субъединица, а αβ-δимер практически не затрагивается. γ-Субъединица термостабильна: при кипячении в кислой среде полипептиды α и β денатурируют и выпадают в осадок, а γ-субъединица остается в растворе и может быть получена в виде гомогенного препарата. Индивидуальную γ-субъединицу можно получить также с помощью гель-фильтрации очищенной ФДЭ при рН 2. Если очищенную γ-субъединицу добавить к активированному димеру ФДЭ_γ, полученному с помощью предварительной трипсинизации, то активность ФДЭ снижается до уровня, соответствующего активности необработанной трипсином ФДЭ. Таким образом, ФДЭ_γ представляет собой термостабильный ингибитор активности фермента.

Следует отметить, что впервые термостабильный белок-ингибитор ФДЭ описан Dumler и Etingoff, а затем рядом других авторов. Молекулярная масса ингибитора, определенная в этих работах, варьирует от 38 до 540 кД. Не вполне понятно, в какой мере эти белки соотносятся с γ-субъединицей ФДЭ, возможно они представляют собой агрегаты ФДЭ с другими полипептидами НСП. В пользу такого предположения говорит то, что в процессе очистки белка-ингибитора ФДЭ его молекулярная масса может снижаться от 60 до 10 кД.

Ингибирующая γ-субъединица способна обратимо связываться с каталитически активным αβ-δимером, полученным путем обработки ФДЭ трипсином. Константа диссоциации гетеротримера ФДЭ на αβ- θ γ- ρубъединицу по разным оценкам варьирует от 0,13 до 15 нМ. При светозависимой активации ФДЭ в препаратах мембран НСП величина K_i для ФДЭ_γ составляет около 440 нМ, т.е. значительно выше, чем для очищенного и обработанного трипсином фермента. В связи с этим высказано предположение, что в естественных условиях активированный светом фермент не вполне аналогичен ферменту, активированному in vitro в результате частичного протеолиза. При этом все же следует заметить, что сродство γ-субъединицы к ферменту, подвергнутому частичному протеолизу непосредственно в препаратах мембран НСП, не измерено, поэтому существует вероятность того, что столь значительное различие в сродстве к ингибирующей субъединице в обоих случаях обусловлено не тем, что в первом из них фермент активирован в результате протеолиза, а во втором – под действием GTP -содержащего трансдуцина, а тем, что в последнем случае на сродство ФДЭ к γ-субъединице влияет локализация на мембранах НСП.

В составе полипептидной цепи γ-субъединицы ФДЭ имеется поликатионный участок, расположенный между Arg²⁴ и Lys⁴⁵, в котором содержится 3 остатка Arg и 7 остатков Lys и нет ни одного остатка дикарбоновых аминокислот (см. рис. 18). Предположительно этот участок играет важную роль во взаимодействии ингибиторной γ-субъединицы с каталитической частью фермента. Такое предположение хорошо согласуется с активацией ФДЭ в присутствии других белков, содержащих поликатионные участки, - гистонов и протамина. Не исключено, что поликатионные белки конкурируют с поликатионным участком γ-субъединицы и ослабляют тем самым ее взаимодействие с αβ-ρубъединицами ФДЭ.

6.3.2. Взаимодействие трансдуцина с ФДЭ

В естественных условиях светозависимая активация ФДЭ является результатом ее взаимодействия с GTP -содержащим трансдуцином. Непосредственным активатором ФДЭ служит GTP -содержащая α-субъединица трансдуцина. Если трансдуцин сначала инкубировать в присутствии фотовозбужденных мембран и ГИДФ, а затем экстрагировать ГИДФ-содержаший трансдуцин и подвергнуть его высокоэффективной гель-проникающей хроматографии, то происходит полное отделение T_βγ от Т_α -ГИДФ. При последующем добавлении разделенных субъединиц к темноадаптированным мембранам НСП, содержащим неактивированную ФДЭ, стимуляция ее активности ваблюдается в том случае, если добавляется Т_α -ГИДФ, а не T_βγ.

Взаимодействие трансдуцина и ФДЭ происходит на мембране. Как уже отмечалось, и трансдуцин и ФДЭ представляют собой периферические мембранные белки, ассоциированные с мембраной при физиологических значениях ионной силы. Хотя прочность ассоциации Т_α с мембраной значительно ослабляется в присутствии GTP, прямые эксперименты по активации ФДЭ в реконструированной система показывают, что ГИДФ-содержащий трансдуцин слабо стимулирует активность очищенной ФДЭ в растворе, но эффективно активирует фермент при добавлении в реакционную смесь темноадаптированных мембран НСП, гетерологичных мембран из других тканей, а также липосом, приготовленных из суммарного соевого фосфолипида.

Активация ФДЭ трансдуцином наблюдается также в реконструированной бесклеточной системе родопсин-трансдуцин-ФДЭ содержащей депипидизированный родопсин в растворе неионного детергента окгилглюкозида. Поскольку оптимальная концентрация детергента в этом случае лежит несколько ниже критической точки его мицеллообразования, то родопсин здесь находится в частично агрегированном состоянии. Возможно, что присутствующие в системе с детергентом агрегаты родопсина выполняют роль гидрофобной "подложки" и способствуют активации ФДЭ трансдуцином.

Каковы молекулярные механизмы взаимодействия между трансдуцином и ФДЭ? По данным Yamazaki и соавт., при добавлении ГИДФ к освещенным мембранам НСП, содержащим трансдуцин и ФДЭ, трансдуцин и термостабильный ингибитор ФДЭ одновременно переходят с мембран в растворимую фракцию. На основании этого сделан вывод, что активация ФДЭ происходит в результате связывания Т_α -ГИДФ с γ-субъединицей ФДЭ и диссоциации комплекса Т_α -ГИДФ-ФДЭ_γ, с мембран, на которых остается связанный каталитический димер ФДЭ_αβ. Иными словами, в соответствии с такой моделью активация ФДЭ является следствием пространственного разобщения ФДЭ_αβ ассоциированной с мембраной, и ФДЭ_γ, переносимой в раствор в составе комплекса с активированной α-субъединицей трансдуцина. Вместе с тем, в этой работе не контролировалась возможность ГИДФ-зависимого перехода в растворимую фракцию самого димера ФДЭ. Таким образом, сделанный в ней вывод представляется недостаточно строго обоснованным.

Значительно более убедительно доказана другая модель взаимодействия ФДЭ и трансдуцина, предложенная в работе. При высокоэффективной хроматографии белков, экстрагированных из освещенных НСП гипотоническим буферным раствором, содержащим негидролизуемый аналог GTP гуанозин-5'-тиотрифосфат (GTPS), наблюдается переход γ-субъединицы ФДЭ в состав комплекса с Т_α -GTPS, который можно получить в очищенном виде. В то время как Т_α -GTPS эффективно активирует ФДЭ в препаратах темноадаптированных мембран НСП, комплекс Т_α -GTPS - ФДЭ_γ уже не способен к этому, и в отличие от Т_α -GTPS он в изотонических условиях преимущественно ассоциирован с мембраной. Кроме того, амплитуда одного из сигналов светорассеяния, отражающих различные стадии активации трансдуцина родопсином, а именно - сигнала диссоциации, который при физиологической ионной силе обусловлен переходом активированной α-субъединицы трансдуцина с мембран в растворимую фракцию (см. также раздел 5), уменьшается пропорционально увеличению содержания ФДЭ на мембранах. На основании этих данных предложена следующая модель взаимодействия ФДЭ с активированным трансдуцином: трансдуцин, связав GTP, диссоциирует на субъединицы; Т_α -GTP связывается с γ-субъединицей ФДЭ, приводя к появлению свободного каталитического димера ФДЭ_αβ и комплекса Т_α –GTP ФДЭ_γ, который остается на мембране, в то время как избыток Т_α -GTP, не связавшийся с ФДЭ, переходит в цитоплазму. В схематичном виде этот процесс представлен на рис. 19. Таким образом, активация ФДЭ обусловлена образованием комплекса между активированной α-субъединицей трансдуцина и ингибиторной γ-субъединицей ФДЭ, который диссоциирует от ФДЭ, оставаясь при этом на мембране.

Рис. 19. Схема взаимодействия между трансдуцином (Т) и ФДЭ в процессе активации фермента (Пояснения в тексте)

Не вполне ясно, насколько необходима диссоциация комплекса Т_α –GTP ФДЭ_γ от ФДЭ_αβ; существует предположение, что для активации ФДЭ достаточно, чтобы Т_α –GTP связалась с целым гетеротримером ФДЭ. Однако в отличие от комплекса Т_α –GTP ФДЭ_γ, комплекс, в состав которого входили бы Т_α –GTP и все три субъединицы ФДЭ, не обнаруживается. Кроме того, данные об инактивации ФДЭ в НСП под действием жесткого β-излучения показывают, что молекулярная масса активированной ФДЭ составляет около 176 кД, и по сравнению с темно-адаптированными НСП изменение ее молекулярной массы не может превышать 27 кД (как в большую, так и в меньшую сторону). Это не противоречит представлениям о диссоциации малой ингибиторной субъединицы ФДЭ (молекулярная масса около 10 кД), но служит аргументом против образования тяжелого комплекса, включающего кроме ФДЭ еще и α-субъединицу трансдуцина (молекулярная масса около 40 кД).

6.4. ФДЭ в палочках и колбочках

Структура ФДЭ из палочек сетчатки позвоночных разных видов весьма консервативна: электрофоретическое сравнение палочковых ФДЭ быка, собаки, лягушки и цыпленка показывает, что они имеют идентичные наборы полипептидов, а анализ их пептидных карт выявляет, по крайней мере, 6 крупных пептидов, идентичных во всех исследованных случаях. Предполагается, что структура фермента из НСП не претерпевала существенных изменений в течение последних 2 миллионов лет эволюционного процесса.

Активность ФДЭ обнаружена не только в палочках, но и в колбочках. Ферменты из наружных сегментов колбочек и палочек близки по ряду каталитических свойств. Колбочковая ФДЭ имеет более высокое сродство по отношению к сGМР, чем к сАМР: соответствующие значения К_m равны соответственно 30-200 и 500-1000 мкМ, хотя максимальные скорости гидролиза обоих субстратов отличаются мало. ФДЭ из наружных сегментов колбочек активируется поликатионными белками, как и ФДЭ из НСП. Кроме того, активность колбочкового фермента возрастает при освещении и после кратковременной обработки трипсином. Несмотря на то, что структура ФДЭ из наружных сегментов колбочек исследована далеко не полно, в составе препарата, содержащего фосфодиэстеразную активность из наружных сегментов колбочек, обнаруживается полипептид с молекулярной массой около 90 кД, что соответствует массе высокомолекулярных субъединиц ФДЭ из НСП. Иммунохимический анализ показывает, что ФДЭ из обоих источников по иммунологическим свойствам подобны, но не идентичны: имеются два типа моноклональных антител, полученных против ФДЭ из НСП, одни из них (моноклональкые антитела ROS—1) распознают общие антигенные детерминанты у ФДЭ из НСП и колбочек, а другие (ROS—2) – реагируют только с ФДЭ из НСП. Наконец, имеется несомненное функциональное сходство между обоими ферментами: активность колбочковой ФДЭ возрастает в присутствии фотовозбужденных мембран, GTP и трансдуцина из НСП.

Учитывая то обстоятельство, что в колбочках присутствует GTP -связывающий белок, черезвычайно похожий по первичной структуре на α-субъединицу трансдуцина, можно полагать, что в них, как и в НСП функционирует фосфодиэстеразный каскад родопсин-трансдуцин-фосфодиэстераза.

6.5. ФДЭ и гуанилатциклаза

ФДЭ участвует в метаболизме cGMP, катализируя его светозависимый гидролиз в НСП. Интенсивный распад cGMP, осуществляемый фосфодиэстеразным каскадом, предполагает также наличие активного синтеза циклического нуклеотида в НСП, Синтез cGMP катализирует фермент гуанилатциклаза, который ассоциирован с аксонемами фоторецепторных клеток. Активность гуанилатциклазы соочищается с фракцией аксонем при фракционировании клеточных компонентов методом центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы даже при экстракции растворами неионных детергентов, например Тритона X-100.

Субстратом для гуанилатциклазы служит комплекс Mg²⁺—GTP, причем Mg²⁺ может быть заменен на Mn²⁺. Кажущаяся константа диссоциации фермент-субстратного комплекса равна 10^-4 – 10^-3 М. Наибольшая активность частично очищенного фермента наблюдается при рН 7-9 она стимулируется КСl и NaCl, особенно при низких концентрациях Mg²⁺. Оптимальные концентрации Mg²⁺ лежат в области 5-10 мМ, дальнейшее повышение концентрации Mg²⁺ вызывает постепенное ингибирование гуанилатциклазы. В присутствии ЭДТА фермент полностью неактивен. Гуанилатциклаза способна катализировать также образование сАМР из АТР, однако ее аденилатциклазная активность в 10-100 раз ниже, чем гуанилатциклазная. Несмотря на то, что фермент ассоциирован с фракцией, содержащей микротрубочки, ни колхицин, ни цитохалазин. В не влияют на активность гуанилатциклазы. Ca²⁺ при концентрации около 10^-3 М оказывает сильное ингибирующее влияние на активность фермента. В отличие от ФДЗ гуанилатциклаза не регулируется светом - во всяком случае на это нет никаких указаний. Соотношение активностей гуанилатциклазы и ФДЭ в клетке на свету, по-видимому, не превышает 1:1000.

7. ФОСФОДИЭСТЕРАЗНЫЙ КАСКАД ФОТОРЕЦЕПТОРНОЙ КЛЕТКИ

В трех предыдущих разделах были описаны структура и функциональные характеристики родопсина, трансдуцина и ФДЭ-белков, образующих светозависимый фосфодиэстеразный каскад, который, скорее всего, служит основным путем передачи рецепторного сигнала в палочках и колбочках сетчатки. Теперь, подводя итог настоящему обзору, дадим общую картину каскада, тех установленных и гипотетических механизмов, которые обеспечивают передачу, усиление, регуляцию и выключение сигнала в цепи родопсин → трансдуцин → ФДЭ.

7.1. Передача и усиление сигнала

Первый участник фосфодиэстеразного каскада - светочувствительный белок родопсин - содержит ковалентно связанную через Шиффово основание хромофорную группу (11-цис-ретиналь), которая после поглощения кванта видимого света (λ » 500 нм) подвергается ряду фотохимических превращений – фотолизу. В процессе фотолиза появляется относительно долгоживущий интермедиат - мета II-родопсин, обладающий способностью избирательно взаимодействовать с нуклеотид-связывающим белком трансдуцином (см. раздел 4).

Трансдуцин может находиться как в GDP-, так и в GTP-форме. В GDP-содержащем трансдуцине нуклеотид прочно связан с белком (К_D =0,1 мкМ), и даже в присутствии свободного GTP (но в отсутствие фотовозбужденного родопсина) связанный нуклеотид практически не обменивается на свободный из-за высокого активационного барьера этой реакции: время GDP/GTP—обмена составляет по меньшей мере несколько часов. GTP/GDP-обмен также сильно затруднен, хотя превращение GTP-трансдуцина в GDP-трансдуцин протекает самопроизвольно благодаря наличию у трансдуцина собственной ГТФазной активности. Существенно, что GDP-трансдуцин может давать прочный комплекс с фотовозбужденным родопсином, тогда как GTP-трансдуцин такой способностью не обладает (см. раздел 5).

Избирательное взаимодействие мета II -родопсина с GDP-трансдуцином в присутствии GTP (а в НСП концентрация GTP-величина порядка миллимолей) сопровождается активацией трансдуцина: связанный с ним GDP обменивается на экзогенный GTP, при этом роль фотовозбужденного родопсина сводится к снижению активационного барьера реакции GDP/GTP-обмена. В процессе реакции GDP-грансдуцин переходит из "закрытой" конформации (К_D = 0,1 мкМ) в "открытую" с относительно низким сродством (К_D = 20 мкМ) к обоим нуклеотидам: GDP и GTP. Но благодаря более высокой концентрации GTP в НСП именно он занимает нуклеотидсвязывающие центры в открытой конформации белка. Как только трансдуцин оказывается в GTP-форме, он диссоциирует из комплекса с фотовозбужденным родопсином, одновременно распадаясь на две функциональные субъединицы: T_α, которая содержит прочно-связанный (К_D = 0,05-0,1 мкМ) GTP, и T_βγ. Этот процесс в реальных условиях практически необратим, т.к. равновесие реакции GDP-трансдуцин +GTP « T_α-GTP + T_βγ + GDP сильно сдвинуто вправо (константа равновесия реакции превышает 100). Активация трансдуцина в НСП протекает с высокой скоростью: GDP/GTP— обмен на одной молекуле трансдуцина занимает около 1 мсек, причем за время фоторецепторного ответа каждая молекула фотовозбужденного родопсина активирует несколько сотен молекул GTP-связывающего белка. Тем самым на первом этапе каскада достигается многократное – в сотни раз – усиление исходного сигнала (см. раздел 5).

Заметим, что высокая скорость активации трансдуцина обусловлена рядом факторов, в частности, такими, как большая скорость диффузии молекул родопсина в фоторецепторной мембране, высокая концентрация трансдуцина в примембранном слое, отсутствие разрыва и образования ковалентных связей в процессе GDP/GTP-обмена.

На втором этапе каскада GTP-содержащая α-субъединица трансдуцина взаимодействует с ингибиторной γ-субъединицей ФДЭ, освобождая фермент от ингибирования, и каталитически активная ФДЭ_αβ начинает гидролизовать cGMP. Гидролиз циклического нуклеотида происходит с очень высокой скоростью, т.к. ФДЭ относится к самым "быстрым" ферментам: ее число оборотов достигает 3000/сек, а величина K_kat/К_М примерно 10⁸ М^-1 сек^-1 (см. раздел 6). Таким образом, на втором этапе каскада может достигаться еще примерно 1000-кратное усиление сигнала: каждая молекула активированной ФДЭ за время фоторецепторного ответа гидролизует порядка 10³ молекул cGMP. И, следовательно, при прохождении через фосфодиэстеразный каскад исходный сигнал может быть усилен в общей сложности более чем в 100 000 раз.

7.2. Выключение и регуляция сигнала

Поскольку электрофизиологический ответ фоторецепторной клетки на световую вспышку не только быстро возникает, но и быстро прекращается, необходимо постулировать существование в НСП механизмов, своевременно "выключающих" фосфодиэстеразный каскад и переводящих его компоненты в исходное возбужденное состояние, т.к. очевидно, что задержка каскада в активированном состоянии дольше, чем того требует быстродействие системы, приведет к нарушению ее функции. Вполне возможно, хотя и не обязательно, что такое совершенное и надежно функционирующее устройство как фоторецептор умеет достаточно быстро выключать каждый из участников каскада: и родопсин, и трансдуцин, и ФДЭ.

7.2.1. Родопсин

У родопсина способность к инактивации заложена уже в самом механизме фотолиза, поскольку образующийся в процессе фотолиза активатор фосфодиэстеразного каскада – метаII-родопсин – через определенное время распадается на "неактивный" опсин и полностью-транс-ретиналь. Однако это время – десятки секунд при физиологических условиях – слишком велико, чтобы обеспечить быструю инактивацию родопсина.

К настоящему моменту накопилось достаточное количество экспериментальных данных, позволяющих утверждать, что в быструю инактивацию фосфодиэстеразного каскада в НСП вовлекается катализируемое родопсинкиназой множественное фосфорилирование родопсина. Так, добавка АТР (но не его негидролизуемого аналога) к суспензии НСП полностью подавляет в ней светозависимую фосфодиэстеразную реакцию в течение нескольких секунд. Аналогичное действие АТР оказывает в реконструированной бесклеточной системе, содержащей фоторецепторные диски, трансдуцин и ФДЭ, но при том необходимом условии, что в системе обязательно присутствует родопсинкиназа – в ее отсутствие ингибирующий эффект АТР не проявляется. Наконец, получены прямые доказательства того, что эффективность родопсина как активатора в системах родопсин-трансдуцин и родопсин-трансдуцин-ФДЭ значительно снижена, если используется его фосфорилированный препарат. Весьма существенно, что в препаратах НСП, плазматическая мембрана которых остается замкнутой после их выделения из сетчатки, фосфорилирование, инициированное слабой вспышкой света, протекает в секундной шкале времени и завершается быстрее (2 секунды), чем АТР-зависимая инактивация ФДЭ (4 секунды). Следовательно, скорость процесса фосфорилирования достаточна для того, чтобы обеспечить своевременный переход фотовозбужденного родопсина в состояние, неспособное активировать фосфодиэстеразный каскад.

Возможно также что в выключении родопсина участвуют присутствующий в НСП белок с молекулярной массой 48 кД, который, по-видимому, способен усиливать ингибируюшее влияние фосфорилирования на эффективность родопсина как активатора фосфодиэстеразного каскада. Однако, по другим данным, ингибируюшее действие этого белка направлено не на родопсин, а на стадию активации ФДЭ трансдуцином, о чем будет сказано ниже.

На индивидуальных формах очищенного делипидизованного родопсина, различающихся по содержанию фосфатных остатков (от 0 до 6 на молекулу белка), показано, что эффективность этих форм как активаторов трансдуцина и ФДЭ тем ниже, чем выше степень их фосфорилирования. Так что не исключено, что фосфорилирование может участвовать не в выключении родопсина, но и вовлекаться в более тонкую его регуляцию как активатора светозависимого фосфодиэстеразного каскада в фоторецепторной клетке.

7.2.2. Трансдуцин

Традиционно принято считать, что активированный трансдуцин переходит в исходное состояние под действием собственной ГТФазной активности. Однако возникает вопрос, каким образом эта активность, гидролизующая связанный с грансдуцином GTP со скоростью один оборот в несколько десятков секунд, может обеспечить быструю – в течение немногих секунд – инактивацию как самого трансдуцина, так и зависящей от него ФДЭ? Для объяснения этого несоответствия была высказана гипотеза о том, что гидролиз GTP на трансдуцине протекает в две стадии: на первой происходит быстрое расщепление фосфодиэфирной связи между β- и γ-фосфатами GTP и соответственно потеря трансдуцином способности активировать ФДЭ, при этом отщепившийся γ-фосфагный остаток все еще остается связанным с белком, возможно даже ковалентно; на второй, лимитирующей стадии фосфат медленно освобождается из активного центра ГТФазы, но т. к. трансдуцин до этого уже фактически перешел в GDP-форму, выброс фосфата никак не коррелирует с реальной инактивацией трансдуцина и соответственно ФДЭ. Оказалось, однако, что в действительности процесс гидролиза GTP на трансдуцине лимитируется, расщеплением β-, γ-τосфодиэфирной связи, а не отщеплением фосфатного остатка от белка. Поэтому остается предположить, что либо ГТФаза трансдуцина не имеет отношения к быстрому выключению фосфодиэстеразного каскада in vivo, а делают это какие-то другие механизмы, либо скорость ГТФазной реакции в физиологических условиях на самом деле много выше, чем это принято считать, но просто на изолированных НСП такие условия не удается воспроизвести. Какая из этих альтернативных возможностей реализуется в действительности, сейчас сказать трудно.

Недавно Rodbell высказал гипотезу о том, что GTP-связывающие белки, опосредующие передачу сигнала в эукариотических клетках, могут подвергаться in vivo ковалентной модификации, которая модулирует передаваемую ими информацию. И действительно есть сведения об эндогенном ADP рибозилировании GTP-связывающего белка в адипоцитах, но имеет ли этот процесс отношение к регуляции передачи сигнала или нет, остается невыясненным. Для трансдуцина подобные факты пока неизвестны, хотя предположение о возможном участии фосфорилирования его α-субъединицы в адаптационных процессах в фоторецепторной клетке высказывались.

7.2.3. Фосфодиэстераза

Механизмы инактивации последнего участника каскада – ФДЭ также остаются предметом дискуссий.

Если исходить из постулата, что ФДЭ активна до тех пор, пока трансдуцин находится в активированном состоянии, то тогда, как и на предыдущем этапе каскада, необходимо каким-то образом преодолеть проблему низкой скорости ГТФазной реакции на трансдуцине либо допустить, что ГТФаза трансдуцина не имеет отношения к быстрому выключению ФДЭ.

Интригующие результаты были получены в работе, согласно которой уже упоминавшийся фоторецепторный белок с молекулярной массой 48 кД в присутствии фотовозбужденного родопсина и АТР переходит в состояние, способное ингибировагь активацию ФДЭ. При этом предполагается, что такой переход происходит в результате ADP/ATP обмена на 48 кД -белке (подобно GDP/GTP-обмену на трансдуцине), и что этот белок конкурирует с трансдуцином за ФДЭ.

В принципе, можно допустить, что 48 кД-белок выполняет двоякую функцию, ингибируя как фотовозбужденный родопсин, так и активацию ФДЭ. Однако результаты этих двух работ не согласуются между собой в некоторых принципиальных моментах, так что сделать окончательный вывод о конкретной роли 48 кД-белка в выключении и (или) регуляции фосфодиэстеразного каскада было бы преждевременным.

О других механизмах регуляции ФДЭ в фоторецепторной клетке ничего неизвестно, а используются ли такие свойства фермента, как чувствительность к ионам кальция и способность подвергаться метилированию (см. раздел 6) в условиях in vivo,ничего определенного сказать нельзя.

Рис. 20. Фосфодиэстеразный каскад и его регуляция. Стрелками обозначены пути активации (сплошными черными) и ингибирования (контурными внутри белыми).

В заключение данного раздела и всего обзора в целом приведем рисунок (рис. 20), который иллюстрирует современные представления о роли фосфодиэстеразного каскада в передаче сигнала от фотовозбужденного родопсина к плазматической мембране и о механизмах регуляции этого каскада в фоторецепторной клетке.

cGMP синтезируется из GTP под действием гуанилатциклазы (ГЦ), связывается с натриевыми каналами в плазматической мембране НСП и держит их в открытом состоянии. Фотовозбужденный родопсин (R*) связывается с GDP -содержащим гетеротримером трансдуцина (Т) и катализирует GDP/GTP